蛋种金鱼(Ranchu)是我国重要的观赏鱼,其背鳍的缺失是蛋种金鱼的主要特征。研究表明eomesa在奇鳍发育中扮演着重要角色,eomesa突变可导致斑马鱼(Danio rerio)、彩鲤(Cyprinus carpHepatoprotective activitiesio var.color)、金鱼(Carassius auratus)背鳍缺失,但也表明eomesa的突变导致了雌性斑马鱼生殖障碍,阻碍了利用eomesa在无背鳍金鱼育种中的应用。eomesa是T-box基因家族重要的转录因子,在胚胎发育中起到重要作用,但其影响雌性斑马鱼生殖障碍的机制未知。本研究以斑马鱼为模型,利用CRISPR/Cas9技术构建eomesa功能缺失突变系,通过繁殖能力分析、繁殖行为观察、卵巢组织学比较分析、性腺发育相关基因的RNA-FISH和q RT-PCR分析eomesa功能缺失对雌性斑马鱼生殖的影响;进一步对野生型和突变体卵巢组织进行了转录组分析,以期探讨eomesa影响斑马鱼生殖的分子机制。1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了eomesa纯合突变系(eomesa~(-/-)),外形和骨骼染色发现eomesa~(-/-)斑马鱼存在两种表型(背鳍缺失和背鳍及臀鳍同时缺失)。繁殖相关实验发现突变体中雄鱼比例显著增加,可自然繁殖;雌鱼可进行求偶配对行为,不能自然排卵BAY 73-4506抑制剂,但可通过人工按压腹部排出成熟卵子,并以人工授精方式获得正常发育的子代。卵巢组织学分析发现eomesa~(-/-)斑马鱼卵巢和输卵管形态正常,组织切片观察显示卵母细胞发育滞后。胚胎发育观察也发现突变体原肠胚外包延迟,且胚胎畸形率显著增加(P<0.001)。此外,与90dpf(days post fertilizatLGX818小鼠ion)野生型相比突变体体长显著增加(P<0.0001)。研究结果表明,eomesa功能缺失使背鳍和臀鳍缺失,体长显著增加;并使雌雄比失调,雌鱼卵母细胞发育滞后,不能自然排卵,且胚胎发育受到影响,胚胎畸形率高。2、通过RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)分析原始生殖细胞发育相关基因vasa、nanos3和精巢发育关键基因dmrt1与eomesa在野生型90dpf斑马鱼性腺组织的共定位,结果显示eomesa在卵巢发育的各时期中均有表达,并与所有基因在卵母细胞的初级生长期中共表达;vasa与eomesa基因在精巢的精原细胞中共表达。采用q RT-PCR分析了6个性腺发育相关基因在突变体12hpf(hours post fertilization)胚胎和45dpf、60dpf、90dpf 3个胚后发育阶段中的表达水平变化,结果表明,原始生殖细胞标志基因dnd1和nanos3在胚胎发育体节期(12hpf)突变体中的表达量显著低于野生型的表达量(P<0.01);dnd1、vasa和nanos3在45dpf时突变体卵巢组织中的表达量显著高于野生型的表达量(P<0.01);在90dpf时突变体卵巢组织中cyp17a1和amh的表达量显著低于野生型的表达量(P<0.01);而dmrt1在突变体中的表达量极显著高于野生型的表达量(P<0.0001)。以上结果说明,eomesa参与性腺发育,影响卵子的成熟度,eomesa敲除干扰了生殖细胞的发育和分化,以及排卵机制,并可能通过影响cyp17a1和dmrt1的表达,使雌雄分化异常。3、对110dpf野生型及两种纯合突变体(背鳍缺失突变体1和背鳍及臀鳍同时缺失突变体2)斑马鱼卵巢组织中进行了转录组测序,结果表明,与野生型相比,突变体1和突变体2显著上调基因分别为121和60个,显著下调基因分别为109和75个,突变体1和突变体2共有33个显著差异表达基因(DEGs)。GO功能富集分析结果显示DEGs显著富集到67个GO基因集,主要参与细胞过程和免疫系统。DEGs显著富集到42条KEGG通路(P<0.05),其中包括Ig A生成相关肠道免疫网、细胞粘附分子、代谢通路、吞噬体和单纯疱疹病毒1型感染。使用GO富集结果构建了基因概念网络图筛选出了10个关键基因,包括参与免疫系统的b2ml、b2m、mhc2a、mhc2dhb和rnf168,参与原始生殖层命运定型和内胚层细胞分化和命运定型的slc25a32a、pou5f3和bmp7a。此外,eomesa功能的缺失还导致atp2b1b的下调,进而影响卵巢组织内的Ca~(2+)稳态。研究表明,eomesa突变可能通过免疫系统、Ca~(2+)稳态、原始生殖层细胞命运分化等调控性腺发育,eomesa功能缺失通过抑制bmp7a和pou5f3的表达影响了卵母细胞发育和成熟,导致卵母细胞发育滞后;通过上调slc25a32a的表达影响卵子的发育质量。综上所述,本研究揭示了eomesa在斑马鱼性腺组织中的空间表达模式,构建了eomesa敲除突变系,从组织学、性腺发育相关基因q RT-PCR和卵巢组织转录组层面,初步探讨了eomesa基因对斑马鱼雌鱼生殖的影响及分子机制,为eomesa基因在蛋种金鱼的分子育种提供理论基础,并为育性可控的鲤科鱼类育种提供理论依据。