研究背景衰老促进了全身多个组织器官中的慢性持续性低度炎症的发展,这种现象被称为炎性衰老(Inflamm-aging)。炎性衰老被认为是促进衰老产生不良后果的重要因素,包括促进年龄相关性疾病,如关节炎、糖尿病、肉瘤、心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)、癌症和痴呆的发生发展。尽管已有强有力的流行病学证据表明,老年人群机体中高水平的促炎标志物与其罹患大多数典型衰老相关疾病以及多种慢性疾病的风险相关,但老年人群机体为何具有促炎状态以及炎症与慢性疾病之间的具体机制目前尚未明确。本研究以炎症作为衰老的发生机制核心,课题通过两部分分别探讨了炎症通路PGF2α通过FP受体在心脏间质纤维化中的作用,明确衰老致心血管疾病发生发展的具体原因;并进一步以炎症因子的发源地——脂肪组织为研究对象,深入探讨了炎性衰老发生发展的分子生物学机制,以期为促进老年人健康和干预衰老进程提供新的思路。首先,流行病学研究显示,随着人口老龄化的加速,全球心血管疾病患病人数与发病率逐年升高。最新研究表明我国人口老龄化是导致心血管疾病死亡率增加的主要驱动因素(占64.11%)。心脏组织主要由心肌细胞和成纤维细胞组成,心脏成纤维细胞占全部细胞总数的2/3。心脏衰老首先表现为心脏成纤维细胞增多。心脏成纤维细胞是心脏结构支架和功能维持的关键细胞。在健康成年人心脏中,心脏成纤维细胞分泌和产生胶原是一个动态平衡的过程,而在老年心脏中,心脏成纤维细胞被激活并获得促纤维化表型,导致心脏间质纤维化、心室僵硬和舒张功能障碍,进而可能导致心力衰竭的发生发展。自噬,作为有效去除和替换受损的蛋白质和细胞器的重要机制,对于维持细胞稳态和延长细胞寿命至关重要。已有研究报道在衰老的心脏中自噬水平明显降低,而自噬水平的提高抑制了年龄诱发的细胞凋亡、炎症增加,以及心脏肥大和纤维化,从而延缓心脏衰老。相关研究证实,心脏成纤维细胞自噬激活可以有效抑制血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的炎症和心脏纤维化;腹腔内注射雷帕霉素可以改善AngⅡ诱导的心脏纤维化和心脏功能障碍。因此,自噬水平提高可以抑制炎症并减少胶原在心脏中的过量沉积从而发挥心脏保护作用,在延缓心脏纤维化与心脏衰老的进程中发挥关键作用。前列腺素(Prostaglandin,PG)是二十碳不饱和脂肪酸花生四烯酸在生理和病理条件下经环氧化酶作用产生的代谢产物,包括PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2及血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)。相关研究证实,在脓毒症患者血浆中PGF2α水平升高,通过抑制PGF2α特异的细胞膜表面受体FP则能够增强抗炎因子白介素10(Interleukin-10,IL-10)的产生从而减轻机体全身炎症反应;此外,PGF2α与FP受体相结合已被证实独立于TGF-β经典通路而直接作用于肺成纤维细胞促进其增殖和胶原的合成,导致肺间质纤维化。相关研究证实,随着年龄的增加,人体内PGF2α的水平也增加,本课题组此前研究证实,FP受体可通过上调Src/PAI-1信号通路促进血管平滑肌衰老,但FP受体在心脏衰老中的作用尚无相关报道。因此本研究提出在衰老小鼠心脏中,FP受体激活促进心脏细胞自噬水平降低,心脏纤维化程度加重,导致心脏衰老,心脏结构和功能受损。鉴于以上假说,本研究在整体和细胞水平探讨了 PGF2α这一炎症通路通过FP受体在心脏衰老中的具体作用及机制。进一步相关研究证实,衰老状态下的机体存在内脏脂肪炎症,促进了炎性衰老和年龄相关损伤的发展。Lumeng等研究发现,在自然衰老小鼠内脏脂肪组织中调节性T细胞数量显著增加,促进了内脏脂肪炎症和全身慢性低度炎症的发生发展;Brigger等研究发现,随着年龄的增长,小鼠内脏脂肪组织中嗜酸性粒细胞数量逐渐下降,促进了全身性低度炎症和与年龄相关损伤的发生,而将年轻小鼠的嗜酸性粒细胞转移到老年小鼠,以恢复内脏脂肪组织中嗜酸性粒细胞分布的方法则被证实显著抑制与年龄相关的慢性低度炎症。作为内脏脂肪组织中的主要免疫细胞,脂肪组织巨噬细胞(Adiposetissue macrophages,ATM)主要包括经典活化的M1型巨噬细胞和选择活化的M2型巨噬细胞,M1型巨噬细胞可以产生高水平的促炎症因子,具有强大的杀菌及杀肿瘤活性,相反地,M2型巨噬细胞吞噬作用强,高表达清道夫分子,可以产生高水平的抗炎症因子。M1型与M2型巨噬细胞可以互相转化,而M1/M2巨噬细胞比例增加,即内脏脂肪组织巨噬细胞极化,相较于单纯的巨噬细胞数目增多进一步加重了内脏脂肪组织炎症。生长停滞特异性蛋白6(Growth arrest-specific protein 6,Gas6)是一个由生长停滞特异性基因6编码的可溶性糖蛋白,与其下游受体Axl常被称为Gas6/Axl通路。此前研究发现在超重及肥胖成年人群中,Gas6/Axl通路与脂肪组织炎症反应密切相关;本课题组此前研究亦证实,Gas6/Axl通路在睾酮延缓血管衰老过程中发挥关键作用。NF-κB作为Gas6/Axl通路的重要下游信号分子,已被证实在免疫介导的肾小球肾炎发病过程中,促进了巨噬细胞极化的发生发展。因此,本研究通过构建WT和Axl-/-自然衰老小鼠模型,观察Axl基因敲除对脂肪衰老的影响,并探讨Gas6/Axl通路在通过减轻脂肪炎症从而改善脂肪衰老中的作用以及可能的机制。第一部分FP受体在心脏衰老中的作用及机制研究研究目的1.探讨FP受体是否影响心脏纤维化和心脏衰老的进程;2.探讨FP受体影响心脏纤维化和心脏衰老的可能机制;3.探讨抑制FP受体表达对衰老的CFs胶原合成的影响;4.探讨FP受体介导的自噬水平降低在CFs衰老及胶原合成中的作用及可能机制。研究方法1.实验动物分组6周龄雄性C57BL/6J野生型(Wild-type,WT)小鼠随机分成四组:年轻组(Young)、衰老组(Old)、衰老+空载体组(Old+FPreceptor vehicle)、衰老+FP受体shRNA组(Old+FPreceptor shRNA)(short hairpin RNA,shRNA)。饲养至 12 月龄后,通过经小鼠尾静脉注射慢病毒致使基因沉默的方式,分别建立衰老+空载体组(Old+FPreceptor vehicle)、衰老+FP受体shRNA组(Old+FPreceptor shRNA)。年轻组小鼠饲养至3月龄,衰老组小鼠饲养18月龄。2.体外实验分组提取小鼠原代心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs),采用最佳浓度D-半乳糖以最佳时间点刺激建立CFs诱导衰老模型。CFs分为五组:对照组(Control)、衰老组(Old)、衰老+AL8810 刺激组(Old+AL8810)(FPrecptor inhibitor,AL8810)、衰老+AL8810+MHY1485 刺激组(Old+AL8810+MHY1485)(mTOR activator,MHY1485)、衰老+AL8810+740Y-P 刺激组(Old+AL8810+740Y-P)(PI3K activator,740Y-P)。3.采用血压仪与超声心动图检测小鼠血压、心脏结构和心脏功能的变化。4.采用实时定量荧光PCR技术检测小鼠心脏组织相对端粒长度的变化。5.采用HE染色、Masson染色、天狼星红染色和免疫组化技术检测小鼠心脏组织形态、纤维化水平的变化。6.采用Vimentin染色鉴定小鼠CFs。7.采用Western blotting技术检测小鼠心脏组织和CFs衰老指标、自噬水平、纤维化水平以及信号通路的变化。8.采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。研究结果1.自然衰老小鼠动物模型的建立与年轻组小鼠相比,衰老组小鼠毛发稀疏、色泽暗淡、行动缓慢,体重呈上升趋势,心脏组织β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,GLB-1)、P53、P21、P16的蛋白表达水平明显升高、相对端粒长度明显缩短,证明成功建立了自然衰老小鼠动物模型。2.衰老小鼠血压明显升高和心脏收缩舒张功能明显降低与年轻组相比,衰老组小鼠收缩压(Systolic blood pressure,SBP)和平均动脉压(Mean blood pressure,MBP)明显增加。与年轻组相比,衰老组小鼠左心室舒张末内径(Left ventricular end diastolc diameter,LVEDd)明显增加、左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)明显降低、左心室缩短分数(Fractional shortening,FS)明显降低、E/e’明显增加。3.衰老小鼠心脏间质纤维化明显增加与年轻组相比,衰老组小鼠心脏发生了一系列病理变化,包括左室扩张、细胞间隙增宽和心肌细胞排列紊乱等,其胶原容积分数、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量均明显增加。4.FP受体表达水平与衰老小鼠心脏间质纤维化相关与年轻组相比,衰老组小鼠心脏组织FP受体蛋白表达水平明显增加。而小鼠心脏组织胶原容积分数和FP受体蛋白表达水平呈正相关。5.FP受体基因沉默能够降低小鼠心脏衰老指标和间质纤维化与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠心脏组织GLB-1、P53、P21、P16的蛋白表达水平明显降低、相对端粒长度明显延长。与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠心脏组织胶原容积分数(Collagen volume fraction,CVF)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量均明显降低。6.FPhepatopancreaticobiliary surgery受体基因沉默能够改善衰老小鼠血压和心脏功能与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠SBP和MBP明显降低。与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠LVEDd明显降低、LVEF和FS明显增加、E/e’明显降低。7.FP受体基因沉默可能通过提高自噬水平延缓小鼠心脏衰老与年轻组相比,衰老组小鼠心脏组织LC3B/A 比值明显降低,P62蛋白表水平明显增加。与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠心脏组织LC3B/A 比值明显增加,P62蛋白表水平明显降低。8.FP受体基因沉默可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调节自噬与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠心脏组织FP受体蛋白表达水平明显降低。与年轻组相比,衰老组小鼠心脏组织PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显增加。与衰老+空载体组相比,衰老+FP受体shRNA组小鼠心脏组织PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显降低。9.FP受体抑制剂AL8810对衰老的CFs FP受体表达的影响由于10 g/L和48h刺激时CFs衰老指标GLB-1和P21的蛋白表达水平明显升高,以此作为D-半乳糖诱导CFs衰老最适作用浓度和作用时间。与对照组相比,衰老组CFs FP受体的蛋白表达水平明显增加。与衰老组相比,衰老+AL8810刺激组CFs FP受体的蛋白表达水平明显降低。10.FP受体抑制剂AL8810对衰老的CFs胶原表达和自噬水平的影响与对照组相比,衰老组CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平明显增加。与衰老组相比,衰老+AL8810刺激组CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平明显降低。与对照组相比,衰老组CFs LC3B/A 比值明显降低,P62蛋白表达水平明显增加。与衰老组相比,衰老+AL8810刺激组CFs LC3B/A比值明显增加,P62蛋白表达水平明显降低。11.FP受体抑制剂AL8810对衰老的CFs PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响与对照组相比,衰老组CFs PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显增加。与衰老组相比,衰老+AL8810刺激组CFs PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显降低。12.mTOR 激活剂 MHY1485 和 PI3K 激活剂 740Y-P 在调节 PI3K/AKT/mTOR 磷酸化水平中的作用与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+MHY1485刺激组CFs PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显增加。与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+740Y-P刺激组CFs PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显增加。13.PI3K/AKT/mTOR信号通路在调控衰老的CFs自噬水平和胶原表达中的作用与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+MHY1485刺激组CFs LC3B/A比值明显降低,P62蛋白表水平明显增加。与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+740Y-P刺激组CFs LC3B/A 比值明显降低,P62蛋白表水平明显增加。与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+MHY1485刺激组CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平明显增加。与衰老+AL8810刺激组相比,衰老+AL8810+740Y-P刺激组CFs Ⅰ型和Ⅲ型胶原的蛋白表达水平明显增加。研究结论1.衰老小鼠心脏FP受体表达显著升高、自噬水平下降、间质纤维化增加,左室收缩及舒张功能显著降低;2.FP受体抑制可能通过抑制P13K/AKT/mTOR信号通路上调CFs自噬水平,减少心脏间质纤维化,明显改善左室收缩及舒张功能,延缓心脏衰老。第二部分Gas6/Axl通路在衰老相关的脂肪组织巨噬细胞极化中的作用及机制研究研究目的1.探讨Gas6/Axl通路在内脏脂肪组织炎症与衰老中的作用;2.探讨GaEntinostat试剂s6/Axl通路是否通过调控内脏脂肪组织中巨噬细胞极化,从而促进内脏脂肪炎症与脂肪衰老;3.探讨衰老状态下Gas6/Axl通路调控内脏脂肪组织巨噬细胞极化的可能机制。研究方法1.实验动物分组40只雄性野生型(WT)小鼠和40只雄性Axl-/-小鼠分别随机分为2组:年轻组(n=20,3月龄),衰老组(n=20,18月龄)。年轻组小鼠饲养至3月龄,衰老组小鼠饲养18月龄。2.采用HE染色、免疫组化技术检测小鼠附睾脂肪组织形态、巨噬细胞、促炎因子以及抗炎因子的变化。3.采用Western blotting技术检测小鼠附睾脂肪组织衰老指标以及信号通路的变化。4.采用SPSS 25.0统计软件进行统计分析。研究结果1.衰老小鼠内脏脂肪Gas6和Axl表达的改变与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Ax-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织Gas6的蛋白表达水平明显降低。与年轻组相比,衰老组小鼠附睾脂肪组织Axl的蛋白表达水平明显降低。Axl-/-基因敲除组小鼠附睾脂肪组织Axl的蛋白表达处于低水平。2.Axl基因敲除加重衰老小鼠内脏脂肪衰老与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织衰老指标GLB-1、P21、P16的蛋白表达水平均明显升高。与衰老组相比,Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织GLB-1、P21、P16的蛋白表达水平升高更为明显。3.Axl基因敲除对衰老小鼠内脏脂肪形态的影响与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪细胞大小形态不一,排列紊乱。与衰老组相比,Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪细胞大小形态不一,排列紊乱更为明显。4.Axl基因敲除加重衰老小鼠内脏脂肪巨噬细胞极化与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织巨噬细胞F4/80、CD11c、CD206的蛋白表达水平均明显升高,M1/M2比值明显升高,但各组脂肪组织CD206表达升高的程度均小于CD11c。与衰老组相比,Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织的F4/80、CD11c的蛋白表达水平升高更为明显,M1/M2比值升高更为明显。5.Axl基因敲除加重衰老小鼠内脏脂肪炎症与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-6和抗炎因子IL-10的蛋白表达水平均明显升高,但各组脂肪组织IL-10表达升高的程度均小于促症因子MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-6。与衰老组相比,Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-1、IL-6的蛋白表达水平升高更为明显。6.Axl基因敲除可能通过NF-κB信号通路调节衰老小鼠内脏脂肪衰老与WT和Axl-/-年轻组相比,WT和Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织NF-κB磷酸化水平明显升高。与衰老组相比,Axl-/-衰老组小鼠附睾脂肪组织NF-κB磷酸化水平升高更为明显。研究结论1.衰老小鼠内脏脂肪组织中Gas6、Axl蛋白表达水平降低;2.衰老小鼠内脏脂肪组织中F4/80、CD11c、CD206表达增加,M1/M2比值升高,Axl基因敲除后这一变化增强,提示Gas6/Axl通路抑制衰老小鼠内脏脂肪组织的巨噬细胞极化,在延缓内脏脂肪组织炎症和脂肪衰老中起重要作用;3.Axl基因敲除可促进衰老小鼠内脏脂肪组织巨噬细胞极化、增强内脏脂肪组织炎症,可能通过影响NF-κB信号通路发挥作用。第三部分SUMO4基因rs237025单核苷酸多态性与代谢综合征体重管理研究研究目的1.探讨SNP rs237025对MetS患病风险和人群携带MetS各组成成分风险的影响;2.探讨SNP rs237025对受访人群临床资料变化的影响,并分析体重管理与rs237025二者交互作用及其对MetS的影响。研究对象及方法本研究选择中国山东省的汉族人群为受访者,于2007年1月至12月期间对目标人群进行访问。我们首先从山东省随机抽取1个村镇和1个城市,分别随机抽取所选村镇和城市的2个社区,社区内每个家庭随机抽取一名成年个体进行调查。最终共招募1047名对照组受访者和1008名MetS组受访者。MetS的诊断参考2009年IDF和AHA/NHLBI联合制定的诊断标准。问卷调查、体征测量、血液标本采集均由专业调研人员实施。问卷包括出生年月、既往病史、用药史、吸烟、饮酒史等详细信息。身高、体重和腰围由2位调研人员重复测量后取平均值。使用欧姆龙HEM-7011电子血压计测量坐姿休息5分钟后右臂血压,每个受访者连续记录3次读数并计算平均值。收集受访者清晨空腹血液样本,立即送检标准化实验室检测血糖、血脂及其他生化指标,并进行DNA提取。rs237025的基因型由Sequenom MassArray基因分型系统检测。我们对调查中诊断为MetS及携带MetS危险因素的患者进行临床建议及指导。5年后随访调查方法同前,共有269名对照组受访者和871名MetS组受访者参与随访。5年随访后各项指标的差值为随访值减去横断面值计算,记为“Δ”。连续变量以均数加减标准差(x±s)表示,并通过独立样本t检验或单向方差分析(one way ANOVA)进行比较。χ2拟合优度检验用于检验SUMO4基因rs237025位点的Hardy-Weinberg平衡。MetS及MetS组成成分的风险因素获悉更多使用多因素逻辑回归分析进行检验;多元逐步线性回归分析基因多态性对MetS组成成分数目及其他临床指标变化的影响。交叉分析(cross-over analysis)用于分析两个自变量之间的交互作用对因变量的影响。所有统计分析均使用SPSS26.0操作。双尾P值小于0.05为存在统计学差异。研究结果1.对照组与MetS组基线比较对照组和MetS组的受访者性别和年龄无显著差异。与对照组相比,MetS组体重、腰围(Waist Circumference,WC)、身体质量指数(Body Mass Index,BMI)、收缩压(Systolic Blood Pressure,SBP)、舒张压(Diastolic Blood Pressure,DBP)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low-Density Lipoprotein-cholesterol,LDL-c)和空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)水平均显著升高,高密度脂蛋白胆固醇(High-Density Lipoprotein-cholesterol,HDL-c)水平显著降低。rs237025位点AA、AG、GG基因型在对照组、MetS组和总体受访者中的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。2.SNP rs237025各基因型临床资料比较对照组中SUMO4基因rs237025位点GG基因型受访者的TG显著高于AA/AG基因型受访者,而在MetS组中,GG基因型受访者的WC和FPG显著高于AA/AG基因型受访者。3.SNP rs237025与MetS及MetS组成成分风险的关系SUMO4基因rs237025位点AA/AG、GG基因型分布在对照组与MetS组之间存在明显差异。对MetS的五个组成成分分别进行研究,rs237025位点AA/AG、GG基因型在WC正常组和WC增加组之间、TG正常组和TG升高组之间、FPG正常组和FPG升高组之间均存在明显差异。进一步研究显示,rs237025位点突变是MetS的独立危险因素,同时rs237025位点突变也是WC增加、TG升高和FPG升高的独立危险因素。4.随访受试者的5年后基线特征变化由于MetS患者在5年间进行了生活方式干预和药物治疗,与对照组相比,MetS组的体重、WC、SBP、DBP、TG、TC、LDL-c、HDL-c和FPG在5年后的下降幅度明显升高。rs237025位点突变在对照组与MetS组中对MetS各组成成分的变化无明显差异。5.SNP rs237025与体重管理的交互作用SNP rs237025与体重管理的交互作用是新发MetS的独立危险因素。对MetS组成成分的变化分别进行研究,SNP rs237025与体重管理的交互作用是随访WC增加、血压升高、HDL-c降低和FPG升高的独立危险因素。Logitic回归模型下的交叉分析显示,SNP rs237025与体重管理对WC、TG和HDL-c的协同效应为负。研究结论1.SUMO4基因rs237025多态性是MetS的独立危险因素,rs237025突变型携带MetS组成成分数目显著增加;2.SUMO4基因rs237025多态性是腰围增加、TG升高和FPG升高的独立危险因素;3.SUMO4基因rs237025多态性与体重管理的交互作用是新发MetS的独立危险因素,也是腰围增加、血压升高、HDL-c降低和FPG升高的独立危险因素,rs237025野生型携带者体重管理不佳时更容易出现腰围增加、血压升高、HDL-c降低和FPG升高。