脑卒中是导致机体死亡和功能残疾的最主要原因之一,其中缺血性脑卒中占脑卒中总数的60%～80%,其高发病率Ascending infection、高死亡率和高致残率给社会、家庭带来沉重负担,给患者带来巨大痛苦。究其原因是因为神经元对缺血极为敏感,经过一定时间的缺血后会大量死亡,且很难再生。因此,如能设法提高神经元对缺血性损害的抵抗力,则有利于提高该病治疗效果。脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIPC)可以保护神经元,使其能够耐受随后可引起神经元损伤的较严重脑缺血,这一现象被称为脑缺血耐受。研究脑缺血预处理诱导脑缺血耐受的产生机制,并据此开发提高神经元对缺血性损害耐受能力的方法,可为临床上缺血性脑卒中的防治提供新思路和线索,具有重要的现实意义。铁死亡(ferroptosis)是一种铁离子依赖的,由于氧化还原平衡破坏,累积的活性氧对整合入膜磷脂的多不饱和脂肪酸过度氧化,超过谷胱甘肽氧化酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)等系统的抗氧化活性,引起细胞膜破坏而导致的不同于其他形式的调节性细胞死亡。在动物大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血性脑卒中模型上证实,铁死亡参与局灶性脑缺血的发病过程,抑制铁死亡可显著缩小脑梗死体积、改善神经行为学评分。但是,脑缺血预处理引起的脑缺血耐受是否与减轻缺血脑组织的铁死亡有关,值得探讨。长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)将多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs),特别是花生四烯酸和肾上腺素酸,激活为酰基辅酶a,然后通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3插入膜磷脂中为膜脂质过氧化提供底物。研究表明,ACSL4通过重塑细胞膜磷脂PUFAs组成影响细胞对铁死亡的敏感性,敲除ACSL4可保护细胞免受铁死亡影响。因此,ACSL4作为催化脂质过氧化反应的关键分子,被认为是预测铁死亡是否被启动的标志分子。研究发现,脑缺血通过ACSL4引起铁死亡和神经炎症,抑制ACSL4可通过抑制铁死亡促进脑卒中后神经功能的恢复。但是,脑缺血预处理是否通过ACSL4发挥保护作用值得探讨。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是指在RNA腺苷酸的第六位氮上发生甲基化,为真核生物mRNA水平上最丰富的表观遗传转录组学修饰。m6A修饰通过甲基化酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白实现对RNA的调控。m6A修饰在神经系统中广泛存在,并且参与神经系统生长发育和神经系统疾病的发生。但是,CIPC诱导脑缺血耐受时,ACSL4表达改变是否由m6A修饰引起,目前尚不清楚。FTO在大脑中高度富集。已有研究发现,MCAO时FTO的mRNA、蛋白及活性均明显降低,导致m6A标记RNA的去甲基化下降,m6A水平增高。那么,FTO是否通过介导ACSL4 m6A修饰调控铁死亡参与脑缺血损伤或诱导脑缺血耐受?目前尚待阐明。SRAMP数据库预测,发现ACSL4 mRNA在终止密码子后存在4个中等可信度以上的m6A修饰位点;m6A2Target数据库预测,发现脂肪肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(insulin like growth factor 2 mRNA binding protein1,IGF2BP1)、IGF2BP3等与ACSL4的mRNA甲基化密切相关。因此,本研究旨在阐明:1)CIPC是否下调ACSL4表达抗脑卒中所致铁死亡而诱导脑缺血耐受;2)CIPC是否通过去甲基化酶FTO调控ACSL4 mRNA的m6A修饰水平,抑制铁死亡诱导脑缺血耐受;3)CIPC是否通过降低m6A阅读蛋白IGF2BP1/3表达,降低ACSL4 mRNA稳定性,下调ACSL4蛋白的表达。第一部分 预处理通过下调ACSL4表达抗脑卒中所致铁死亡而诱导脑缺血耐受目的:阐明CIPC是否通过下调ACSL4表达抗脑卒中所致铁死亡而诱导脑缺血耐受。方法:1.CIPC减轻脑缺血所致铁死亡而诱导脑缺血耐受1.1 CIPC可诱导C57BL/6J小鼠脑缺血耐受雄性C57BL/6J小鼠采用改良的Longa线栓法建立MCAO模型。实验动物分为4组(n=5):1)假手术(Sham)组:仅分离颈外、颈内动脉,不置入线栓;2)CIPC组:缺血10 min后拔出线栓,恢复血流;3)MCAO组:缺血90 min后拔出线栓,恢复血流;4)CIPC+MCAO组:缺血10 min后拔出线栓恢复血流,间隔72 h,再缺血90 min后拔出线栓使大脑中动脉再通。恢复血流24 h后,取脑,通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,检测脑梗死体积。1.2 CIPC对脑缺血所致铁死亡的影响雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:1)Sham组;2)CIPC组;3)MCAO组;4)CIPC+MCAO组。恢复血流12 h,取缺血半影区脑组织,western blot检测ACSL4、GPX4和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)表达(n=3);透射电镜观察神经元线粒体超微结构(n=3);硫代巴比妥酸法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,酶联免疫吸附法检测4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal acid,4HNE)含量(n=5)。1.3铁死亡抑制剂对MCAO小鼠脑梗死体积的影响实验动物分为2组(n=5):1)MCAO+Vehicle组:MCAO前30min侧脑室注射3μl溶媒;2)MCAO+Fer-1组:MCAO前30 min侧脑室注射3μl铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)。恢复血流24 h后,取脑,TTC染色,检测脑梗死体积。2.IPC减轻HT22细胞氧葡萄糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)后铁死亡而诱导OGD耐受2.1 IPC可诱导HT22细胞OGD耐受参照Ryou的方法建立OGD模型。HT22细胞随机分为4组:1)Control组:只换液,不进行OGD处理;2)IPC组:HT22细胞更换无糖培养基,进行1 h OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱;3)OGD组:HT22细胞更换无糖培养基,进行6 h OGD,处理完毕后更换正常培养基,放置于常氧培养箱;4)IPC+OGD组:先进行OGD1 h处理,间隔24 h后,再行OGD 6 h处理。复糖复氧24 h后,通过CCK8检测细胞活力(n=3);Hoechst 33342-碘化丙啶(Hoechst-PI)染色检测细胞死亡(n=5)。2.2 IPC对HT22细胞OGD后铁死亡的影响实验分为4组:1)Control组;2)IPC组;3)OGD组;4)IPC+OGD组。复糖复氧24 h后,western blot检测Nirmatrelvir细胞培养ACSL4、GPX4和FTH表达(n=3);C11 BODIPY 581/591荧光探针法检测膜脂质过氧化水平(n=3)。3.ACSL4在预处理诱导脑缺血耐受中的作用3.1 ACSL4 mRNA在CIPC诱导脑缺血耐受中表达水平的改变实验动物分为4组:1)Sham组;2)CIPC组;3)MCAO组;4)CIPC+MCAO组。恢复血流12 h,取缺血半影区脑组织,qRT-PCR检测ACSL4 mRNA表达(n=3)。3.2 ACSL4在IPC诱导HT22细胞OGD耐受中表达水平的改变实验分为4组:1)Control组;2)IPC组;3)OGD组;4)IPC+OGD组。qRT-PCR检测ACSL4 mRNA表达(n=3);免疫细胞荧光检测ACSL4的表达(n=3)。3.3过表达ACSL4可减弱IPC对OGD的保护作用实验分为3组:1)IPC+OGD组;2)LV-NC+IPC+OGD组:IPC后感染慢病毒LV-NC,再行OGD 6 h处理;3)LV-ACSL4+IPC+OGD组:IPC后感染慢病毒LV-ACSL4,再行OGD 6 h处理。复糖复氧24 h后,Hoechst-PI染色检测细胞死亡、CCK8检测细胞活力以及通过酶联免疫吸附法检测脂质过氧化物产物MDA和4HNE含量(n=3)。结果:1.CIPC减轻脑缺血所致铁死亡而诱导脑缺血耐受1.1 CIPC可诱导C57BL/6J小鼠脑缺血耐受连续脑切片TTC染色结果表明:Sham和CIPC小鼠脑组织未见任何缺血征象;MCAO再灌注24 h,连续多个脑切片左侧大脑区域出现大范围梗死,但未超过中线;MCAO前72 h行CIPC操作,可显著减少MCAO小鼠的脑梗死体积(P<0.05)。1.2 CIPC可减轻C57BL/6J小鼠脑缺血所致铁死亡(1)CIPC对C57BL/6J小鼠MCAO后铁死亡相关蛋白表达的影响:Western blot结果显示,与Sham组比较,CIPC组ACSL4的表达有所升高,但差异无显著性;MCAO组ACSL4的表达显著升高(P<0.05);但是,MCAO前72 h行CIPC可显著抑制MCAO引起的ACSL4增加(P<0.05)。与Sham组比较,MCAO组GPX4的表达显著下降(P<0.05),CIPC可显著抑制MCAO引起的GPX4降低(P<0.05)。与Sham组比较,CIPC组FTH的表达有所升高,但未见统计学差异,MCAO组FTH的表达显著升高(P<0.05);但是,MCAO前的CIPC可显著抑制MCAO引起的FTH的表达上调(P<0.05)。(2)CIPC对MCAO小鼠脑皮质缺血半影区神经元线粒体超微结构的影响:透射电子显微镜观察结果显示,与Sham组相比,CIPC组脑皮质神经元线粒体无明显变化。与Sham组相比,MCAO组小鼠脑皮质缺血半影区神经元广泛分布缩小、膜密度增高、嵴减少或消失、外膜破裂的受损线粒体。CIPC可使MCAO后脑皮质缺血半影区神经元线粒体的损伤显著减轻。(3)CIPC对MCAO小鼠脑皮质MDA和4HNE含量的影响:与Sham组相比,CIPC组脑皮质MDA和4HNE含量无显著变化。与Sham组相比,MCAO脑皮质匀浆上清液中MDA和4HNE的含量显著增加(P<0.05),CIPC可显著抑制MCAO后脑皮质匀浆中MDA和4HNE含量的增加(P<0.05)。1.3铁死亡抑制剂对MCAO小鼠脑梗死体积的影响:TTC结果显示,与溶媒对照比较,预先经侧脑室注射铁死亡抑制剂Fer-1可显著缩小MCAO小鼠的脑梗死体积(P<0.05)。2.IPC减轻HT22细胞OGD后铁死亡而诱导OGD耐受2.1 IPC可成功诱导OGD耐受CCK-8细胞活力检测显示,与Control组相比,IPC组HT22细胞活力无显著差异,OGD后HT22细胞生长活力显著降低(P<0.05),与OGD组相比,IPC处理可显著抑制OGD对HT22细胞活力的损害作用(P<0.05),即IPC可成功诱导OGD耐受。Hoechst-PI染色结果显示,OGD 6 h处理HT22细胞的死亡率显著增加(P<0.05)。OGD前24 h行IPC处理1 h,可显著降低OGD 6 h处理HT22细胞的死亡率(P<0.05)。2.2 IPC对HT22细胞OGD后铁死亡的影响(1)IPC对HT22细胞OGD后铁死亡相关蛋白表达的影响:Western blot结果显示,与Control组比较,IPC组ACSL4蛋白表达水平有所升高,但差异无显著性,OGD组ACSL4蛋白表达水平显著增加(P<0.05);但是,与OGD组比较,IPC+OGD组ACSL4的表达显著降低(P<0.05)。与Control组比较,IPC组GPX4的蛋白表达有所降低,但未见统计学差异,OGD组GPX4的蛋白表达显著下调(P<0.05);IPC显著抑制OGD引起的GPX4蛋白表达下调(P<0.05)。与Control组比较,IPC组和OGD组FTH的表达均显著升高(P<0.05),并且OGD组显著高于IPC组(P<0.05);但是,与OGD组比较,IPC+OGD组FTH的表达显著降低(P<0.05)。(2)IPC对HT22细胞OGD后脂质过氧化水平的影响:C11BODIPY 581/591是一种膜脂质过氧化荧光探针,C11 BODIPY阳性反应是铁死亡的重要特征之一。流式细胞术检测显示,与Control组相比,IPC对HT22细胞的C11 BODIPY 581/591阳性率无明显影响。与Control组相比,OGD后HT22细胞的C11 BODIPY 581/591阳性率急剧增加(P<0.05),这一变化可被提前进行的IPC显著抑制(P<0.05)。3.ACSL4在预处理诱导脑缺血耐受中的作用3Trichostatin A作用.1 ACSL4 mRNA在CIPC诱导脑缺血耐受中表达水平的改变qRT-PCR检测结果显示,与Sham组比较,CIPC组ACSL4 mRNA的表达有所升高,但无统计学差异,MCAO组ACSL4 mRNA的表达显著增加(P<0.05),但,CIPC可显著抑制MCAO导致的ACSL4 mRNA表达增加(P<0.05)。3.2 ACSL4在IPC诱导HT22细胞OGD耐受中表达水平的改变qRT-PCR检测结果显示,与Control组相比,IPC对ACSL4 mRNA水平无显著影响。ACSL4 mRNA的表达在OGD后显著升高(P<0.05),这种升高趋势可被IPC显著抑制(P<0.05)。免疫荧光染色检测发现,HT22细胞ACSL4蛋白表达趋势与mRNA一致,即OGD后ACSL4蛋白的荧光信号显著升高,这种升高趋势可被IPC显著抑制。3.3过表达ACSL4可减弱IPC对OGD的保护作用Hoechst-PI染色实验结果显示,LV-NC+IPC+OGD组与IPC+OGD组细胞的死亡率未见显著差异;与LV-NC+IPC+OGD组比较,感染LVACSL4显著减弱了IPC对OGD处理HT22细胞的保护作用(P<0.05)。CCK8细胞活力分析结果显示,与IPC+OGD组比较,LV-NC+IPC+OGD组的HT22细胞活力未见明显改变,但是,LV-ACSL4感染可使IPC+OGD处理的HT22细胞活力显著降低(P<0.05)。膜脂质过氧化产物检测结果显示,IPC+OGD组与LV-NC+IPC+OGD组MDA和4HNE含量未见显著差异,感染LV-ACSL4后IPC+OGD处理HT22细胞MDA和4HNE含量显著增加(P<0.05)。以上结果表明,过表达ACSL4可减弱IPC对OGD的保护作用,ACSL4可能是IPC减轻HT22细胞OGD后铁死亡的关键靶点。小结:CIPC通过下调ACSL4表达抗脑卒中所致铁死亡而诱导脑缺血耐受。第二部分 预处理通过上调去甲基化酶FTO表达降低ACSL4 mRNA的m6A修饰目的:本部分研究生信分析基础上,旨在阐明预处理通过上调去甲基化酶FTO表达降低ACSL4 mRNA的m6A修饰水平诱导脑缺血耐受。方法:1.IPC对HT22细胞OGD后ACSL4 mRNA m6A修饰水平的影响实验分为4组(n=3):1)Control组;2)IPC组;3)OGD组;4)IPC+OGD组。复糖复氧24 h后,甲基化mRNA免疫共沉淀(methylated RNA immuno-precipitation,Me RIP)联合q PCR检测ACSL4 mRNA在3'-UTR端预测的m6A修饰位点的甲基化水平。2.FTO在CIPC诱导脑缺血耐受过程中的表达变化实验分为4组(n=3):1)Sham组;2)CIPC组;3)MCAO组;4)CIPC+MCAO组。恢复血流12 h,取缺血半影区脑组织,提取蛋白,western blot检测FTO的表达。3.FTO在IPC诱导HT22细胞OGD耐受过程中的表达变化实验分为4组(n=3):1)Control组;2)IPC组;3)OGD组;4)IPC+OGD组。复糖复氧24 h后,提取蛋白,western blot检测FTO蛋白表达。4.过表达FTO对HT22细胞ACSL4蛋白表达的影响实验分为两组(n=3):1)pc DNA3.1-NC组:HT22细胞转染pc DNA3.1-NC质粒;2)pc DNA3.1-FTO组:HT22细胞转染pc DNA3.1-FTO质粒。Western blot检测FTO和ACSL4的表达。结果:1.IPC对HT22细胞OGD后ACSL4 mRNA m6A修饰水平的影响运用SRAMP预测ACSL4 mRNA的潜在m6A修饰位点。结果显示,终止密码子后存在4个超过中等可信度的潜在m6A修饰位点,分别为2908、3345、3822和4994。围绕4个预测到的潜在m6A修饰位点设计引物,Me RIP联合qRT-PCR检测各组细胞ACSL4 mRNA m6A修饰水平。结果表明,与Control组比较,IPC组ACSL4 mRNA m6A修饰水平未见明显改变,而OGD组ACSL4 mRNA m6A修饰水平在2908、3345、3822和4994四个位点均显著增高(P<0.05)。但是,与OGD组比较,IPC+OGD组ACSL4 mRNA m6A修饰水平在2908、3345和3822三个位点显著降低(P<0.05)。2.FTO在CIPC诱导脑缺血耐受过程中的表达变化Western blot结果显示,与Sham小鼠比较,CIPC处理小鼠脑皮质FTO的表达未见明显改变;然而,MCAO后FTO的表达显著降低(P<0.05),但CIPC逆转了MCAO引起的FTO低表达状态(P<0.05)。3.FTO在IPC诱导HT22细胞OGD耐受过程中的表达变化Western blot结果显示,与Control组相比,IPC处理HT22细胞FTO的表达未见明显改变;但是,OGD后FTO的表达明显降低(P<0.05),IPC逆转了OGD引起的FTO表达下降(P<0.05)。4.过表达FTO对HT22细胞ACSL4蛋白表达的影响HT22细胞转染pc DNA3.1-FTO质粒后,western blot检测FTO和ACSL4的表达。结果显示,与pc DNA3.1-NC比较,pc DNA3.1-FTO质粒显著上调FTO的表达(P<0.05),同时显著抑制ACSL4的表达(P<0.05)。小结:CIPC通过抑制去甲基化酶FTO表达下调使ACSL4 m6A修饰水平降低,降低ACSL4蛋白的表达。第三部分 预处理通过降低m6A阅读蛋白IGF2BP1/3表达降低ACSL4 mRNA稳定性目的:本部分研究生信分析的基础上,旨在阐明预处理通过降低m6A阅读蛋白IGF2BP1和IGF2BP3表达,使其对ACSL4 mRNA稳定作用减弱,降低ACSL4 mRNA翻译效率,下调ACSL4蛋白的表达,抑制铁死亡诱导脑缺血耐受。方法:1.IGF2BP1/3在CIPC诱导脑缺血耐受中的表达雄性C57BL/6J小鼠分为4组(n=3):Sham组;2)CIPC组;3)MCAO组;4)CIPC+MCAO组。恢复血流12 h,取缺血半影区脑组织,提取蛋白,western blot检测IGF2BP1和IGF2BP3的表达。2.IGF2BP1/3在IPC诱导HT22细胞OGD耐受中的表达HT22细胞分为4组(n=3):1)Control组;2)IPC组;3)OGD组;4)IPC+OGD组。复糖复氧24 h后,提取蛋白,western blot检测IGF2BP1和IGF2BP3的表达。3.IPC对HT22细胞OGD后ACSL4 mRNA稳定性的影响实验分为2组(n=3):OGD和IPC+OGD组。以上各组复糖复氧24h后,经放线菌素D处理不同时间,qRT-PCR检测ACSL4 mRNA水平,确定mRNA衰减速率。4.敲低IGF2BP1/3对HT22细胞OGD后ACSL4表达的影响(1)敲低IGF2BP1对HT22细胞OGD后ACSL4表达的影响:实验分为2组(n=3):1)si RNA-NC+OGD组,OGD处理前HT22细胞转染si RNA-NC,48 h后行OGD处理;2)si RNA-IGF2BP1+OGD组,OGD处理前HT22细胞转染si RNA-IGF2BP1,48 h后行OGD处理。复糖复氧24 h后,提取蛋白,western blot检测IGF2BP1和ACSL4的表达。(2)敲低IGF2BP3对HT22细胞OGD后ACSL4表达的影响:实验分为2组(n=3):1)si RNA-NC+OGD组,OGD处理前HT22细胞转染si RNA-NC,48 h后行OGD处理;2)si RNA-IGF2BP3+OGD组,OGD处理前si RNA-IGF2BP3转染HT22细胞,48 h后行OGD处理。复糖复氧24 h后,提取蛋白,western blot检测IGF2BP3和ACSL4的表达。结果:1.IGF2BP1/3在CIPC诱导脑缺血耐受中的表达Western blot结果显示,与Sham组比较,CIPC组IGF2BP1和IGF2BP3的表达均无显著变化。与Sham组相比,MCAO组小鼠脑缺血半影区IGF2BP1和IGF2BP3的表达均显著升高(P<0.05),而CIPC可显著抑制MCAO诱导的IGF2BP1和IGF2BP3上调(P<0.05)。2.IGF2BP1/3在IPC诱导HT22细胞OGD耐受中的表达Western blot结果显示,与Sham组比较,IPC组IGF2BP1和IGF2BP3的表达均无显著变化。IGF2BP1和IGF2BP3在OGD处理的HT22细胞上表达显著增强(P<0.05),IPC显著抑制了OGD引起的IGF2BP1和IGF2BP3表达上调(P<0.05)。3.IPC对HT22细胞OGD后ACSL4 mRNA稳定性的影响ACSL4 mRNA降解实验显示,5μg/ml放线菌素D可显著抑制ACSL4 mRNA的合成;但是,给予放线菌素D后4 h和6 h时间点上,IPC+OGD组HT22细胞ACSL4 mRNA的水平显著低于OGD组(P<0.05)。对各时间点mRNA水平均值进行拟合绘制降解曲线,OGD组半衰期为5.668 h、IPC+OGD组半衰期为4.366 h。这些结果提示,IPC处理可加速ACSL4 mRNA的降解。4.敲低IGF2BP1/3对HT22细胞OGD后ACSL4表达的影响为进一步验证m6A阅读蛋白IGF2BP1/3是否直接调控ACSL4的表达,IGF2BP1/3 si RNA转染HT22细胞后进行OGD,然后western blot检测IGF2BP1/3和ACSL4的表达。结果显示,si RNA-IGF2BP1转染可显著抑制HT22细胞OGD后IGF2BP1的表达(P<0.05),并且,si RNAIGF2BP1也能有效抑制ACSL4的表达(P<0.05)。同样,si RNAIGF2BP3转染可显著抑制HT22细胞OGD后IGF2BP3的表达(P<0.05),并且,si RNA-IGF2BP3也能有效抑制ACSL4的表达(P<0.05)。小结:CIPC通过降低m6A阅读蛋白IGF2BP1和IGF2BP3的表达,使其对ACSL4 mRNA稳定作用减弱,下调ACSL4蛋白的表达。结论1.CIPC通过下调ACSL4表达抗脑卒中所致铁死亡而诱导脑缺血耐受。2.CIPC通过抑制去甲基化酶FTO表达下调,使ACSL4 m6A修饰水平降低,降低ACSL4蛋白的表达。3.CIPC通过降低m6A阅读蛋白IGF2BP1和IGF2BP3的表达,使其对ACSL4 mRNA稳定作用减弱,下调ACSL4蛋白的表达。综上,CIPC通过调控FTO和IGF2BP1/3,下调ACSL4蛋白表达抑制铁死亡诱导脑缺血耐受。