背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率均位于前五位。由于发病隐匿,70%的患者就诊时已失去根治性手术的时机。我国肝细胞癌发病机制多数在病毒性肝炎基础上发展而来,主要病理特征是肝炎病毒引起免疫应答使得肝细胞损伤,反复的炎症存在,导致肝细胞癌变的发生。肝细胞癌的发病机制与分子生物学息息相关,故寻找HCC治疗新靶点,是目前肝癌研究的热点。目的检测GINS复合物4(GINS complex subunit4,GINS4)在肝细胞癌组织及其对应癌旁组织中的表达,分析GINS4与肿瘤大小、TNM分期、分化程度、脉管癌栓、细胞增殖抗原-67(Cell proliferation antigen-67,Ki-67)等临床病理参数的相关性;分析GINS4在肝癌细胞株中的表达水平,降低GINS4表达量后对肝癌细胞生物学表型的影响,进一步探索GINS4可能影响HCC进展的机制。方法使用在线生物学信息库GEPIA、Kalpan-Meier Plotter、Ualcan数据库分析GINS4在肝细胞癌组织及正常组织中的表达,实时荧光定量PCR技术(Real time Quantitative PCR,q RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western Blot,WB)实验分别检测GINS4在临床收集85例肝细胞癌患者肿瘤标本及其对应癌旁组织的表达量,并同时检测肝癌细胞株(PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh7、Hep G2、SK-HEP-1)及其正常肝脏细胞(HL-7702)的表达量。免疫组织化学法检测GINS4在肝细胞癌组织中的表达,评估其与临床病理特征相关性。根据q RT-PCR、Western Blot实验检测GINS4在肝癌细胞株的表达情况,筛选出GINS4在肝癌细胞株表达量最高的细胞株SK-HEP-1,构建短发卡RNA(short hairpin RNA,sh RNA)进行靶向GINS4敲低,将sh RNA稳定转染至SK-HEP-1细胞中,分为对照组(NC组)及实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)。q RT-PCR、Western Blot分别检测敲低效果,并进行敲低细胞转录组测序;细胞集落形成实验检测SK-HEP-1细胞的集落形成能力,细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)实验检测SK-HEP-1细胞敲低后的增殖效率变化;划痕实验评估SK-HEP-1细胞的迁移能力,Transwell实验通过细胞穿过小室的数量来检测SK-HEP-1细胞的迁移能力,流式细胞学实验检测SK-HEP-1细胞的周期变化,Western Blot实验检测SK-HEP-1细胞的周期相关蛋白变化、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮间质转化)相关蛋白表达变化和RAS/RAF/MEK/ERK信号通路可能影响肝癌细胞的机制。结果GEPIA数据库下发现GINS4在人类多种肿瘤中如胰腺癌、肝癌、肺癌、子宫体子宫内膜癌等肿瘤组织中表达升高,且在Kalpan-Meier Plotter公共平台中发现GINS4在胰腺癌、肝细胞癌、肺癌、子宫体子宫内膜癌肿瘤组织中表达量高的较表达量低的预后差(P均<0.001)。同时在Ualcan数据库中显示GINS4在肝细胞癌组织中的表达较正常组织表达升高(P<0.0001),且表达量越高的患者,预后越差(P<0.001)。q RT-PCR结果显示GINS4在肝细胞癌组织表达水平高于其对应的癌旁组织的表达水平(P<0.0001);在肝癌细胞株(PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh7、Hep G2、SK-HEP-1)表达量均高于肝脏正常细胞(HL-7702)表达量(P均<0.05),以SK-HEP-1表达量最高。Western Blot实验结果显示GINS4在肝细胞癌组织中的表达量高于癌旁组织的表达量;GINS4在肝癌细胞株(PLC/PRF/5、SMMC-7721、Huh7、Hep G2、SK-HEP-1)中表达水平高于肝脏正常细胞(HL-7702)的表达水平。免疫组织化学实验表明GINS4表达量与HCC肿瘤大小、TNM分期、脉管癌栓、分化程度、Ki-67呈正相关;且GINS4主要表达于胞核中,胞质中亦有部分表达。使用表达量最高的肝癌细胞株SK-HEP-1构建稳定低表达的细胞株,Western Blot、q RT-PCR发现敲低GINS4后,在肝癌细胞株SK-HEP-1中实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)表达量较对照组(NC组)表达量低,在SK-HEP-1细胞株中实验组中表达量均不同程度下降,以实验组中sh-GINS4-2、sh-GINS4-3敲低效果好;降低GINS4表达后,实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)细胞集落形成数目明显小于对照组(NC组)(P均<0.05)。CCK-8实验中,敲低GINS4后,实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)肝癌细胞在OD450nm处的吸光度较对照组(NC组)明显减弱(P均<0.05)。ALK抑制剂划痕实验表明低实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)肝癌细胞相对迁移距离较对照组(NC组)明显减小(P<0.001、P<0.01、P<0.0001)。Transwell实验中,实验组(sh-GINS4-1、sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)肝癌细胞的穿过Transwell小室的数目较对照组(NC组)明显减少(P<0.05、P<0.01、P<0.001)。在检测EMT相关蛋白实验中,实验组(sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)中Vimentin、N-cadherin蛋白的表达水平低于对照组(NC)蛋白的表达水平,E-cadherin蛋白中实验组(sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)的表达水平高于对照组(NC)蛋白的表达水平表达量。在流式细胞学实验中,实验组(sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)细胞的细胞周期进程阻滞在G0/G1期,阻止了细胞周期G1期向S期转变;Western Blot实验检测实验组Gut microbiome(sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)周期相关蛋白,实验组(sh-GINS4-2、sh-GINS4-3)中在敲低细胞中周期相关蛋白Cyclin A2、CDK2蛋白的表达水平低于对照组(NC)蛋白的表达水平。将敲低组细胞进行sh RNA测序,经GO、KEGG富集分析,与GINS4表达富集度最高的是MAPK信号通路,Western Blot实验检测RAS水平表达下降,同时发现对磷酸化的RAF、MEK、ERK蛋白的表达水平均不同程度下降。结论1.GINS4在肝细胞癌组织中及肝癌细胞中表达较高,且表达越高的患者预后越差。2.GINS4与HCC肿瘤大小、TNM分期、脉管癌栓、分化程度、Ki-67呈正相关。3.沉默GINS4表达后,可明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移,影响肝癌细胞的G0/G1期向S期转化。4.GIGSK1349572采购NS4可能通过Ras/Raf/MEK/Erk信号通路、EMT信号通路,促进肝癌细胞的发生、发展。