目的:年龄相关性白内障(Age-related cataract,ARC)目前最有效的治疗方法为手术干预,但仍存在诸多问题(例如术后并发症等),而其发病机制尚未完全明确为探索防治药物的主要限制瓶颈。有研究表明,ARC发病机制主要基于晶状体上皮细胞(Lens epithelial cells,LECs)的氧化损伤,而氧化损伤诱导的细胞铁死亡是导致年龄相关性疾病等发生的主要原因之一。另外,核因子E2相关因子2(Nuclearfactor erythroid 2-relatedfactor 2,Nrf2)是细胞抗氧化途径中的重要调控因子,通过与其下游靶基因的抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE)结合,介导铁死亡途径中的多个关键基因转录异常,调控细胞铁死亡。同时,糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthasekinase-3β,GSK-3β)可以调控Nrf2的蛋白降解水平。因此,本课题着力于研究GSK-3β是否通过调控Nrf2蛋白降解途径影响Nrf2活性和LECs抗氧化能力,引起细胞内铁死亡相关基因表达异常,使细胞内谷胱甘肽(Glutathione,GSH)减少、Fe2+和脂质过氧化物积累,诱导LECs发生铁死亡,最终促进ARC发生的机制。方法:(1)年龄相关性白内障中晶状体上皮细胞发生铁死亡:利用裂隙灯显微镜观察ARC患者和24月龄C57BL/6J小鼠(老龄小鼠)晶状体,获取囊膜后利用H&E染色、透射电子显微镜、western blot法和免疫荧光染色技术检测LECs铁死亡水平的改变。利用尾静脉注射碘酸钠(NaIO3,50mg/kg)构建氧化应激诱导的小鼠白内障模型,利用体视显微镜观察小鼠模型是否出现晶状体,利用H&E染色、Lillie二价铁染色、western blot法和免疫荧光染色技术检测小鼠模型检测LECs铁死亡改变。利用2.5mM NaIO3处理人晶状体上皮细胞系HLE-B3细胞24小时,用铁死亡抑制剂、凋亡抑制剂和坏死性凋亡抑制剂预处理HLE-B3细胞2小时,用CCK-8实验检测细胞活性,判断该细胞模型的主要死亡形式;用ROS试剂盒、MDA试剂盒、FerroOrange染色、GSH/GSSG试剂盒、western blot法检测细胞模型中氧化损伤和铁死亡水平,在体外构建氧化应激诱导的LECs模型。(2)Nrf2对晶状体上皮细胞铁死亡的调控作用:利用western blot法检测ARC患者、老龄小鼠、氧化应激诱导的小鼠白内障模型晶状体囊膜和氧化应激诱导的LECs模型中Nrf2及其抗氧化损伤途径下游基因HO-1的蛋白表达水平。获取尾静脉注射NaIO3的全身性Nrf2基因敲除小鼠和同窝野生型(WT)小鼠的晶状体囊膜,利用Lillie二价铁染色、免疫荧光染色检测LECs铁死亡水平。利用细胞转染技术下调HLE-B3细胞中Nrf2的表达水平,利用Nrf2激动剂tBHQ预处理的方法上调HLE-B3细胞中Nrf2的表达水平,在氧化应激诱导的LECs模型中,利用ROS试剂盒、FerroOrange染色、western blot法检测LECs氧化损伤和铁死亡水平。(3)GSK-3β依赖性Nrf2蛋白降解途径对晶状体上皮细胞铁死亡的调控作用:利用western blot和免疫荧光染色法检测ARC患者、老龄小鼠、氧化应激诱导的小鼠白内障模型晶状体囊膜和氧化应激诱导的LECs模型中Nrf2、Keapl和GSK-3β在蛋白水平的表达变化,并利用RT-PCR检测氧化应激诱导的LECs模型中Nrf2和Keapl在RNA水平的表达变化。利用GSK-3β抑制剂SB216763(10μM)在体外预处理HLE-B3细胞2小时,利用ROS试剂盒、MDA试剂盒、FerroOrange染色、western blot法和免疫荧光共定位法检测氧化应激诱导的LECs模型铁死亡水平和Nrf2、GSK-3β蛋白表达水平。将SB216763腹腔注射(10mg/kg,于每次注射NaIO3前3天,每日1次)至小鼠体内,获取氧化应激诱导的小鼠白内障模型晶状体囊膜后利用H&E染色、Lillie二价铁和免疫荧光染色检测LECs铁死亡水平。结果:(1)与轻度ARC患者相比,重度ARC患者LECs密度降低、细胞核形态改变、排列紊乱,线粒VE-822化学结构体出现典型的铁死亡改变,TfR1、FTH1蛋寻找更多白水平增高,SLC40A1、GPX4蛋白水平降低。与对照组相比,老龄小鼠LECs也出现与上述类似的实验结果,提示LECs中出现铁死亡,且铁死亡水平随着ARC的加重Antipseudomonal antibiotics而增高。尾静脉注射NaIO3后,小鼠晶状体出现白色混浊,LECs中Fe2+累积增多、铁死亡相关蛋白水平改变,提示成功利用NaIO3在体内构建氧化应激诱导的小鼠白内障模型。CCK-8结果提示铁死亡抑制剂对HLE-B3细胞活性挽救效果最好,表明铁死亡是该模型中细胞死亡的主要形式;NaI03组HLE-B3细胞中ROS、MDA、Fe2+水平显著增高,细胞内GSH水平显著降低,铁死亡相关蛋白水平改变,提示成功利用NaIO3在体外构建氧化应激诱导的LECs模型。(2)在ARC患者、老龄小鼠、氧化应激诱导的小鼠白内障模型晶状体囊膜和氧化应激诱导的LECs模型中,Nrf2和HO-1的蛋白表达水平显著下降,提示Nrf2水平降低导致细胞抗氧化能力下降。尾静脉注射NaIO3后,全身性Nrf2基因敲除小鼠的LECs中Fe2+水平较WT组显著增多,铁死亡关键蛋白表达改变更加显著,以上体内实验提示Nrf2的缺失加剧了 LECs铁死亡。在氧化应激诱导的LECs模型中,转染si-Nrf2加剧了 NaIO3导致的细胞中铁死亡关键蛋白表达变化,而tBHQ缓解了 NaIO3导致的细胞中铁死亡关键蛋白表达变化、细胞内ROS和Fe2+水平的增多,以上结果提示Nrf2在LECs铁死亡中发挥重要调控作用。(3)ARC患者、老龄小鼠、氧化应激诱导的小鼠白内障模型晶状体囊膜和氧化应激诱导的LECs模型中Nrf2和Keap1的蛋白水平均下降,然而LECs模型中Nrf2在RNA水平的表达无明显变化,提示Nrf2蛋白降解增多,且非Keap1介导;同时GSK-3β的蛋白质表达水平显著增加,利用SB216763(GSK-3β抑制剂)预处理HLE-B3细胞,结果显示SB216763显著抑制了 NaIO3造成的细胞内ROS、MDA和Fe2+的积累和铁死亡关键蛋白表达改变。将SB216763腹腔注射至小鼠体内,显著抑制了 NaIO3导致的LECs死亡、细胞内Fe2+积累以及死亡关键蛋白表达的改变,以上结果提示GSK-3β依赖性Nrf2蛋白降解途径对晶状体上皮细胞铁死亡的调控作用。结论:本研究表明,在机体衰老的过程中,晶状体上皮细胞受到刺激发生氧化应激,激活细胞内GSK-3β表达,使Nrf2蛋白降解增多。Nrf2蛋白表达水平减少,与其下游铁死亡关键基因的抗氧化反应元件结合并调控其表达,使SLC7A11、GPX4和SLC40A1表达减少,TfR1和FTH1表达增加,从而导致细胞内谷胱甘肽水平降低、Fe2+水平增加,进一步促进活性氧和脂质过氧化物积累,加剧晶状体上皮细胞铁死亡,最终促进年龄相关性白内障的发生。