目的:探讨人内源性逆转录病毒-H长末端重复关联蛋白质2(HHLA2)在胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1中的表达及对其生物学功能的影响,并研究HHLA2在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。制备一株新的抗人HHLA2单克隆抗体并对其生物学功能进行鉴定。方法:通过慢病毒转染技术构建HHLA2稳定上调表达的人胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1,通过qRT-PCR、流式细胞术分别在RNA水平和蛋白水平验证两株细胞系中LV-HHLA2-OE组与LV-NC组HHLA2的表达差异,并进一步通过BrdU增殖实验、划痕实验、细胞凋亡及细胞周期实验检测HHLA2在调节胰腺癌细胞生物学功能中的作用。通过转录组测序进一步探究HHLA2在胰腺癌细胞株中表达的潜在作用机制。应用胰腺癌组织芯片,利用多色荧光标记技术分析了 63例胰腺癌组织中HHLA2、B7-H3和B7-H4的表达情况以及CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞(CD68+Mac)的浸润程度,应用t检验比较这些分子及细胞在胰腺癌组织和癌旁组织中表达及浸润的差异,应用χ2检验分析胰腺癌组织中CD8+T细胞和CD68+Mac的浸combined bioremediation润程度及HHLA2、B7-H3和B7-H4表达水平与患者临床病理特征的关系,应用Kaplan-Meier生存分析法观察HHLA2、B7-H3和B7-H4表达水平及CD8+T细胞和CD68+Mac的浸润程度与胰腺癌患者总生存期(OS)的关系,拟合Cox模型评价不同指标与患者预后的关系。采用杂交瘤技术,筛选获得一株能稳定分泌特异性鼠抗人HHLA2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,从中提取重链可变区(mVH)和轻链可变区(mVL),并测序验证,在此基础上实施真核细胞株表达抗体,应用免疫组织化学染色、流式细胞术及Western blot实验技术比较分析自行制备的单抗与商品化HHLA2抗体对同一类样本检测的效果和特异性。结果:qRT-PCR结果证实,LV-HHLA2-OE组HHLA2 mRNA表达水MDV3100研究购买平均显著高于 LV-NC 组(BxPC-3:P<0.0001;PANC-1:P<0.0001)。流式细胞术结果证实,LV-HHLA2-OE组HHLA2蛋白表达水平均显著高于LV-NC组(BxPC-3:P<0.0001;PANC-1:P<0.001)。划痕实验证实LV-HHLA2-OE组的迁移能力明显高于LV-NC组(BxPC-3:P<0.selleck05;PANC-1:P<0.01)。Brdu增殖实验显示,BxPC-3细胞系在培养1天后,LV-NC组细胞增殖能力较LV-HHLA2-OE组显著增强,差异有统计学意义(P<0.0001),而在培养4天后,两组的增殖能力无显著差异。PANC-1细胞系在培养1天后LV-NC组和LV-HHLA2-OE组增殖能力无明显差异,培养4天后,发现LV-NC组较LV-HHLA2-OE组相比,增殖能力显著增强,差异有统计学意义(P<0.05)。凋亡实验显示LV-HHLA2-OE组的早期凋亡率显著低于LV-NC组(BxPC-3:P<0.01;PANC-1:P<0.05)。细胞周期实验显示两株细胞的LV-HHLA2-OE组和LV-NC组周期分布均无显著差异。多色荧光标记结果显示,肿瘤细胞上B7-H3高表达组患者OS显著优于低表达组。肿瘤细胞上HHLA2和B7-H3的表达呈正相关。CD68+Mac上B7-H3和HHLA2或B7-H4的表达都呈正相关。肿瘤浸润性CD8+T细胞联合CD68+Mac可作为预测胰腺癌患者术后预后的重要指标。CD68+Mac上HHLA2高表达以及B7-H3高表达都是胰腺癌患者预后变差的危险因素。此外,我们成功制备了一株能稳定分泌鼠抗人HHLA2单克隆抗体的杂交瘤细胞,并经实验验证该抗体具有良好的结合能力。结论:上调HHLA2表达可影响胰腺癌细胞株的细胞学功能。CD68+Mac上HHLA2及B7-H3的表达水平、CD8+T细胞及CD68+Mac的浸润程度可作为预测胰腺癌患者术后预后的重要指标。此外,我们成功制备并鉴定了一株新的鼠抗人HHLA2单克隆抗体。