革兰氏阴性溶杆菌属于γ-变形菌纲黄单胞科,对多种植物病原真菌、细菌、卵虫和线虫均具有显著拮抗活性,是一类新型植物病害生防细菌。溶杆菌能够代谢产生多种结构类型复杂、活性显著的天然产物,是发现活性天然产物的新资源。其中,产酶溶杆菌C3具有显著的抗植物致病真菌和线虫病害活性,通过开展其抗真菌成分的生物合成机制研究,有望通过合成生物学手段进一步提升菌株的抗真菌防效。与此同时,通过完善产酶溶杆菌C3的遗传操作体系,引入外源抗细菌生防物质,系统挖掘本源活性成分,有望拓展并提升其生防效力,从而推动溶杆菌生防菌剂的开发与利用。基于上述研究背景,本论文开展了产酶溶杆菌C3抗真菌化合物HSAF和其同家族成员pseudoamides的多环体系合成机制研究,以及菌株C3的生防效力改良和活性产物挖掘。1.HSAF多环体系合成机制MDV3100体内实验剂量:通过同位素标记实验和标记产物的分离鉴定,揭示了醇脱氢酶OX4通过延长的1,6迈克尔加成反应合成HSAF内侧6元环,明确了OXMC3临床试验4催化反应的底物区域选择性和立体选择性。通过对HSAF基因簇进行黄素依赖性氧化还原酶基因的组合生物合成改造,首次在体内证明OX1和OX2可能通过环化-羟基化偶联反应合成HSAF内侧5元环。通过在大肠杆菌BAP1中共表达负责多烯前体合成的PKS/NRPS合酶CbmA和负责5/5双环形成的OX1、OX2、OX3,明确了大肠杆菌可合Proteomics Tools成活性OX重组蛋白。2.Pseudoamides 5/5双环合成机制:通过体内组合生物合成、体外生化和同位素标记实验,阐明了负责pseudoamides 5/5双环合成的黄素依赖性氧化还原酶Pel1和Pel3的催化机制。Pel1和Pel3的催化功能均依赖还原伴侣进行电子传递。其中,Pel1通过还原性[2+3]环加成反应合成外侧5元环,引入的两个氢分别来自FMNH2和H2O;Pel3可能依赖FMN-C4a-hydroxyperoxide实现环化-羟基化偶联反应合成内侧5元环,羟基氧来源于O2。3.产酶溶杆菌C3的生防效力改良和活性产物发现:(1)通过筛选活性启动子、建立位点特异性整合系统和CRISPR-Cpf1基因编辑系统,逐步完善了产酶溶杆菌C3的分子遗传操作体系。(2)利用活性启动子和位点特异性整合系统成功实现了抗生素溶杆菌ATCC 29479来源的吩嗪生物合成基因簇在菌株C3的异源表达,获得了细菌拮抗活性显著提升的工程菌C3-cophz和C3-phz。(3)利用同源重组策略构建了C3主产物连续敲除突变株C3ΔHWL。利用生物活性追踪分离法,首次从溶杆菌中分离鉴定了具有抗细菌和抗真菌活性的已知化合物吡咯-2-羧酸。综上所述,本论文通过体内外研究解析了 5/5/6三环HSAF和5/5双环pseudoamides的多环体系合成机制,部分解答PoTeMs多环体系合成的共性问题,不仅为HSAF类化合物的组分简化和活性改良奠定了基础,而且为后续PoTeMs的多环体系改造提供了新催化元件和理论依据。此外,通过完善产酶溶杆菌C3的遗传操作体系,引入外源抗细菌吩嗪类化合物,显著提升了产酶溶杆菌C3的生防效力,为其开发为优良生防菌剂奠定了基础。