背景脑小血管病(Cerebral small vessel disease,CSVD)是指一组由不同病因所致的、脑小血管和脑实质受累的、以反复脑卒中发作和血管性认知障碍为特征的综合征。NOTCH3基因突变引起的伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CADASIL)是最常见的单基因遗传性CSVD,以偏头痛、反复发作性缺血性脑卒中、认知障碍和情感障碍为常见症状。然而,在临床实践中发现部分具有CADASIL相似临床表型的患者并未携带NOTCH3基因突变,而是携带HTRA丝氨酸蛋白酶1(Htr A serine protease-1,HTRA1)基因杂合突变。这种由HTRA1基因杂合突变引起的、发病较晚的、常染色体显性遗传模式的CSVD称为HTRA1相关脑小血管病(HTRA1-Cerebral small vessel disease,HTRA1-CSVD)。研究表明,近5%的具有家族史的CSVD与HTRA1基因杂合突变有关,但目前对HTRA1-CSVD的临床认知有限,且它的发病机制并不十分清楚。目的对临床上疑似CADASIL但NOTCH3基因2-24号外显子致病突变检测为阴性的河南汉族CSVD患者进行HTRA1基因筛查,分析并总结HTRA1-CSVD患者的临床特征。研究HTRA1基因杂合突变对细胞表型的影响,探讨HTRA1-CSVD可能的发病机制,为阐明疾病的发生发展以及寻找潜在靶向药物提供理论依据。方法首先采用Sanger测序以及全外显子组测序对临床上疑似CADASIL但NOTCH3基因2-24号外显子致病突变检测为阴性的130例河南汉族CSVD患者进行HTRA1基因全部外显子的筛查,对筛查到的HTRA1基因杂合突变进行生物信息学分析以及致病性评估。回顾性分析了HTRA1-CSVD患者详细的临床资料,并总结临床以及影像学特征。最后,体外构建野生型(Wild type,WT)、突变型(G283R和S328A)HTRA1过表达质粒,转染人胚胎肾293T(Human embryonic kidney 293T,HEK 293T)细胞,并观察HTRA1基因杂合突变对HTRA1蛋白酶活性、TGF-β1信号传导及细胞凋亡的影响。使用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析和绘图。数据采用未配对t检验和单因素方差分析进行比较更多,并以平均值±标准差表示。p<0.05被认为差异具有显著性。结果本研究发现了6种HTRCross-species infectionA1基因杂合突变,分别是c.242G>A(p.G81D),c.412C>T(p.R138C),c.715G>A(p.E239K),c.847G>A(p.G283R),c.923G>C(p.G308A)和c.992C>T(p.P331L),其中5种突变为首次报道。6例携带HTRA1基因杂合突变的患者,分别来自6个无相关家系,其中2例女性,4例男性。首次缺血性脑卒中年龄为42～71岁,均存在脑卒中或血管性痴呆的家族史。临床特点主要是复发性缺血性脑卒中(5例),认知功能障碍(5例),情绪障碍(4例),脱发(2例)及脊椎病(4例)。磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)显示6例患者均有脑白质高信号和腔隙性脑梗死,5例有脑微出血,4例有脊椎受累。我们通过体外实验发现G283R突变组HTRA1蛋白酶活性较WT HTRA1组明显降低(p<0.0001),与S328A突变组HTRA1蛋白酶活性相当,这可能与G283R突变对WT HTRA1蛋白酶产生了显著的www.selleck.cn/products/empagliflozin-bi10773显性负效应(p<0.05)有关。与WT组相比,G283R突变组中TGF-β1/Smad信号传导上调(p<0.05),cleaved caspase3蛋白和BAX蛋白的表达水平升高(p<0.05),而BCL-2蛋白的表达水平降低(p<0.01),细胞内线粒体膜电位明显降低(p<0.01),细胞凋亡水平显著增加(p<0.01)。而这些改变可以被SB431542(TGF-β1/Smad信号通路抑制剂)明显改善(p<0.05)。结论1、对临床疑似CADASIL的CSVD患者,当NOTCH3基因2-24号外显子致病突变检测为阴性时,需要进行HTRA1基因的筛查。2、G283R HTRA1杂合突变通过产生显性负效应引起HTRA1蛋白酶活性丧失,导致TGF-β1/Smad信号传导上调,进而可能通过线粒体功能障碍诱导细胞凋亡。3、TGF-β1/Smad信号传导抑制剂有望成为治疗HTRA1-CSVD的潜在治疗药物。