目的:血管重构是众多血管疾病的关键病理过程,主要由血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)大量增殖导致血管壁增厚和管腔狭窄,而VSMC表型转化作为血管重塑性疾病的Talazoparib体内实验剂量主要原因,其作用机制仍然值得深究。近年来,研究发现VSMC表型转化是由代谢转换驱动的,包括有氧糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸代谢。在动脉粥样硬化斑块的形成过程中,VSMCs由收缩表型转变为合成表型,并伴随有氧糖酵解增强,通过改变细胞代谢来满足生物能量和生物合成的要求。据报道,在动脉粥样硬化患者斑块中,糖酵解途径和磷酸戊糖途径明显增强。糖代谢关键酶的表达及活性变化在VSMC表型转化过程中具有重要作用,如己糖激酶2(Hexokinase 2,HK2)、丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)、乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)以及磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase 1,PFK1)。本研究以LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生动物模型和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-BB诱导的增殖型VSMCs为研究对象进行蛋白质组学分析,重点观察血管重构中糖代谢相关酶的变化,并且对PFK1在VSMC增殖中的作用机制进行探讨。方法:利用WT、LDLR+/-以及LDLR-/-仓鼠筛选并建立LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生动物模型,应用小动物B超、HE染色及免疫荧光染色进行检测验证,确定建立最适宜的动物模型。然后,对LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生动物模型的颈总动脉组织以及增殖型VSMCs进行蛋白质组学分析,对检测到的差异蛋白质进行GO分析以及KEGG Pathway富集分析,确定感兴趣的差异蛋白质,应用Western Blot分析以及冰冻切片组织免疫荧光对其进行验证。之后利用si PFKL对目的蛋白质PFKL进行敲低,应用交联实验及PFK1活性检测试剂盒对PFK1四聚体活性形式进行检测,应用CCK8以及细胞计数来检测PFK1在VSMCs中的作用及功能,并通过增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的检测判断VSMC增殖。最后通过免疫沉淀实验验证PFK1乙酰化修饰水平,应用去乙酰化酶抑制剂(Trichostatin A,TSA;Nicotinamide,NAM)抑制乙酰化降解,并应用免疫沉淀检测PFK1乙酰化的变化,应用去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)小干扰RNA si HDAC6/8敲低内源性HDAC6/8,寻找PFK1的去乙酰化酶,验证并阐明PFK1乙酰化修饰对VSMC增殖的影响。结果:1.LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型的建立与鉴定1.1仓鼠左侧颈总动脉结扎后血流速度峰值明显下降利用脉冲多普勒成像技术对血流速度峰值进行测量,结果显示,WT、LDLR+/-与LDLR-/-仓鼠左侧颈总动脉结扎后,血流速度峰值迅速下降。与WT仓鼠相比,LDLR+/-和LDLR-/-仓鼠结扎后,血流速度峰值下降更加显著。以上结果表明,左侧颈总动脉结扎后仓鼠左侧颈动脉血流受阻,血流速度峰值明显下降,并且LDLR缺失对于血流速度峰值下降的程度有所影响。1.2仓鼠左侧颈总动脉结扎后血管壁厚度明显增加小动物B超结果显示,随着结扎时间的延长,WT、LDLR+/-与LDLR-/-仓鼠血管壁厚度均显著增加。并且,结扎14 d后,与WT相比,LDLR+/-和LDLR-/-仓鼠左侧颈总动脉血管壁增厚程度具有显著差异,而LDLR+/-与LDLR-/-仓鼠之间相比无统计学意义。HE染色结果也显示,WT、LDLR+/-与LDLR-/-仓鼠随着结扎时间的延长,血管壁内膜显著增厚,且LDLR+/-和LDLR-/-仓鼠血管内膜中膜比(I/M)明显增加,与WT相比,差异具有统计学意义。免疫荧光染色结果显示,左侧颈总动脉结扎后,PCNA表达量明显增加。由于LDLR+/-仓鼠即可迅速表现出血管损伤后内膜增生的症状,因此,选用LDLR+/-仓鼠左侧颈总动脉结扎模型进行后续蛋白质组学分析。1.3左侧颈总动脉结扎后对仓鼠心脏功能及右侧颈总动脉无影响小动物B超结果显示,随着结扎时间的延长,WT、LDLR+/-和LDLR-/-仓鼠的心脏射血分数(EF)略有变化,但无统计学意义。此外,仓鼠心电图监测结果显示,结扎14 d时,WT、LDLR+/-、LDLR-/-仓鼠的QT间期稍有延长,但是没有统计学意义,之后又恢复到正常水平。由此可见,左侧颈总动脉结扎对仓鼠心脏功能无显著影响。另外,脉冲多普勒成像技术及小动物B超结果显示,WT、LDLR+/-与LDLR-/-仓鼠右侧颈总动脉血流速度峰值并不受左侧颈总动脉结扎的影响,血管壁厚度同样不受左侧颈总动脉结扎的影响。综上所述,仓鼠左侧颈总动脉结扎对其心脏功能及右侧颈总动脉的形态及功能均无明显影响。2.增殖型VSMCs与LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型蛋白质组学分析2.1增殖型VSMCs蛋白质组学分析基因本论(Gene Ontology,GO)分类中,生物进程(Biological process,BP)中差异蛋白富集分析显示,增殖型VSMCs的BP发生了许多异常变化,如:核苷酸磷酸化、辅因子和辅酶的代谢过程、碳水化合物代谢过程、磷酸核糖和单羧酸的代谢、羧酸、有机酸和酮酸的代谢过程;细胞组成(Cellular component,CC)分类发现,差异表达蛋白质主要在(minichromosome maintenance complex,MCM)复合物、张力纤维、DNA包装复合物、收缩肌动蛋白丝束、肌动球蛋白以及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)富集;分子功能(Molecular function,MF)分类显示,大部分差异表达蛋白质与裂合酶活性(羧基裂解酶,碳碳裂解酶)hospital-associated infection、连接酶活性、氧化还原酶活性和异构酶活性有关。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析显示,糖代谢通路(糖酵解、糖异生、磷酸戊糖途径等)以及氨基酸的生物合成发生了显著变化,同时对碳、半乳糖、果糖、甘露糖、丙酮酸以及各种氨基酸的代谢也有显著影响。由此可见,在PDGF-BB诱导增殖型VSMCs中,多种代谢途径异常,这对VSMC存活、增殖、迁移以及表型转化发挥着非常重要的作用。2.2 LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型蛋白质组学分析LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型颈总动脉组织蛋白质组学分析显示,GO分类中,BP分类差异蛋白质富集分析显示,LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生血管的BP发生了许多异常变化,如:鞘糖脂代谢过程、ATP水解耦合跨膜运输、补体激活调节、急性炎症反应的调节;CC分类发现,差异表达蛋白质主要在糖蛋白复合物(尤其是肌营养不良的糖蛋白复合物)、及核糖体(胞质核糖体、核糖体亚单位)富集;MF分类显示,大部分差异表达蛋白质与ATP酶活性(钙运输、阳离子运输、氢外排相关ATP酶活性)有关。KEGG富集分析显示,鞘糖脂的生物合成和糖胺聚糖的降解等代谢通路发生了显著变化,同时对血管平滑肌收缩,以及扩张型心肌病(DCM)、肥厚型心肌病(HCM)也有显著影响。2.3增殖型VSMCs与LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型蛋白质组学的综合分析及验证应用韦恩图对LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型及增殖型VSMCs中的差异蛋白质取交集进行分析,结果显示,同时出现在两种模型中的差异蛋白质有130个,其中表达上调的67个,表达下调的63个。再次对这些差异蛋白质进行GO分类和KEGG富集分析,结果显示:BP分类表明,在碳水化合物代谢过程中,有多种蛋白质表达异常;CC分类可见肌动蛋白细胞骨架构成有差异;MF分类显示在细胞黏附功能中差异蛋白质富集。KEGG富集分析显示,差异蛋白质主要集中在磷酸戊糖途径、糖酵解和糖异生等糖代谢途径,占差异此网站蛋白质的25%。对糖酵解途径中差异丰富的蛋白质进行统计标记,结果显示,糖酵解途径中,PFKL、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglycerate mutase,PGM)、烯醇化酶(enolase)、LDHA上调,丙酮酸脱氢酶(Pyruvate Dehydrogenase,PDH)下调。针对糖酵解过程中的关键酶PFKL和LDHA,分别采用Western Blot分析和免疫荧光染色方法对蛋白质组学中的结果进行了验证,Western Blot检测显示,与对照组相比,增殖型VSMCs中LDHA和PFKL表达水平显著上调。免疫荧光染色结果显示,在LDLR+/-仓鼠中,结扎21d后,与对照组相比,左侧颈总动脉PFKL和LDHA的表达也显著升高。3.磷酸果糖激酶-1去乙酰化促进VSMC增殖3.1增殖型VSMCs中PFKL表达增加、活性增强PFK1分为3个亚型,肌亚型(PFKM)、血小板亚型(PFKP)和肝亚型(PFKL),Western Blot检测结果表明,PDGF-BB刺激后,VSMC中PCNA表达量显著增加,SM22α和α-actin表达量明显下降,VSMC由收缩表型转化为合成表型,且PDGF-BB刺激24 h后PFKL的表达量明显增加,PFKM表达量仅在48 h明显升高,而PFKP表达量变化基本不明显。应用戊二醛交联实验检测PDGF-BB刺激前后PFKL的活性改变,并同时应用PFK1活性检测试剂盒辅助验证,结果发现,PDGF-BB刺激后不仅PFKL表达量增加,四聚体形式也明显增加。可见在增殖型VSMCs中PFKL表达量及活性均明显升高。3.2敲低PFK1表达可以抑制VSMC生长利用特异性si RNA敲低PFK1表达后,即使加入PDGF-BB刺激,VSMCs中PCNA表达也会显著下降,VSMC数量也明显下降,CCK8细胞活力检测结果同样显示,敲低PFK1表达后,VSMC活力明显下降,且乳酸产生明显受到抑制。以上结果表明,敲低PFK1可以显著抑制糖酵解,进而抑制VSMC生长。3.3抑制PFK1乙酰化可以促进其活化免疫沉淀检测结果显示,PDGF-BB刺激后,PFK1乙酰化水平明显下降。当加入去乙酰化酶抑制剂TSA后,PDGF-BB引起的PFK1乙酰化下降得到了逆转,PFK1四聚体形式也明显减少,活性明显下降。应用TSA后,PCNA表达明显减少,VSMC数量明显下降,细胞活力明显下降。此外,应用TSA后,VSMC乳酸产生明显受到抑制,表明PFK1乙酰化修饰可明显抑制VSMC糖酵解以及细胞增殖,可能是通过抑制PFK1酶活性介导的。3.4 HDAC6可以催化PFK1发生去乙酰化TSA可以抑制PFK1去乙酰化过程,HDAC6敲低后具有类似效果,且敲低HDAC6可显著抑制VSMCs中PFK1酶活性,使PCNA表达量明显下降,细胞数量及细胞活力也显著下降,乳酸生成明显减少,表明HDAC6可以通过抑制PFK1乙酰化提高其酶活性以及有氧糖酵解过程,进而促进VSMC增殖。结论:1.LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型是研究血管重塑性疾病的良好动物模型。2.增殖型VSMCs与LDLR+/-仓鼠动脉损伤后内膜增生模型中差异蛋白质主要集中在糖代谢途径,其中PFKL与LDHA的表达均明显升高。3.在增殖型VSMCs中,HDAC6介导PFK1去乙酰化,进而增强其酶活性,促进有氧糖酵解途径,加剧VSMC增殖。