研究背景:心脏瓣膜病(Valvular Heart Disease,VHD)是由各种原因引起的单个瓣膜或多瓣膜病变,造成血流动力学改变最终导致心功能异常的一种疾病。瓣膜置换术是目前治疗心脏瓣膜病的一种有效方案,随着经导管瓣膜置换术(Transcatheter Aortic Valve Replacement,TAVR)的快速发展,生物瓣的适用人群越来越多。生物瓣相比于机械瓣来说虽然优势较多,但其钙化的发生率也相对较大,瓣膜的使用寿命因此大打折扣。临床上应用广泛的商业化生物瓣多数是异种瓣膜,通常用戊二醛(Glutaraldehyde,Glut)进行交联处理,虽然很大程度上改善了机械性能和耐久性,但同时也不可避免地增加了瓣膜钙化的风险。因此,探索一种新型交联方法替代戊二醛,提高生物瓣的抗钙化性能是目前亟待解决的临床难题。茶多酚(Tea Polyphenol,TP)是茶叶中所有多酚类化合物的总称,有多种生理活性,在抗氧化、降血脂、降血糖等方面发挥了重要的作用。茶多酚中丰富的酚羟基能与羟基、羧基等基团结合形成氢键,有效地完成生物材料内部的交联。茶多酚还有一些较为独特的性质,如可以在溶液中与金属离子有效结合形成多功能的金属@多酚纳米颗粒,同时具备茶多酚和金属离子的双重特性,以更好地发挥特定的生物学效应。Mg~(2+)是细胞内含量最多的二价阳离子,参与调节多种生理、生化过程。现已证实,Mg~(2+)是Ca~(2+)的天然拮抗剂,可以有效减缓甚至抑制钙化的发生。因此本研究拟通过制备Mg@TP交联处理的脱细胞牛心包(Mg@TP-Decellular Bovine Pericardium,Mg@TP-DBP),观察验证其物理化学性质和材料学表征,进一步对抗钙化性能进行研究,为预防和治疗生物瓣钙化提供新的思路。研究目的:(一)构建出Mg@TP-DBP;(二)对Mg@TP-DBP的生物相容性、物理性能和交联特性等进行评估;(三)建立Mg@TP-DBP大鼠皮下包埋模型,对Mg@TP-DBP的体内钙化情况进行定性和定量评估;(四)Mg@TP-DBP的抗钙化Gefitinib细胞培养研究。方法:(一)Mg@TP-RSL3溶解度DBP的构建1、使用真空冻融法制备出脱细胞牛心包(Decellular Bovine Porcine,DBP),对脱细胞效果和力学性能进行检测。2、课题组前期实验基础已经确定TP的最佳处理条件,为更好地确定Mg~(2+)处理条件,通过CCK-8法检测牛心包浸提上清对小鼠成纤维细胞(L929细胞)的细胞毒性。3、将制备好的Mg@TP-DBP分别在p H=4、5、6、7.4的PBS缓冲液中,于多个时间点(1-7天、14天、21天)收集上清,使用镁离子检测试剂盒测定离子释放率。(二)Mg@TP-DBP的生物相容性、物理性能以及交联特性分析1、通过CCK-8法和流式细胞术检测Mg@TP-DBP对人源性脂肪间充质干细胞的细胞相容性,通过红细胞溶血率评估Mg@TP-DBP的血液相容性。2、使用游标卡尺测量Mg@TP-DBP的厚度,并用Glut-DBP和DBP作为对照组。3、根据牛心包放入蒸馏水前后的重量,计算出Mg@TP-DBP的含水量。4、通过透射电子显微镜对所形成的Mg@TP纳米颗粒进行直接观察。5、使用茚三酮溶液处理Mg@TP-DBP,检测570nm处的吸光度从而量化交联度。6、使用I型胶原酶评估Mg@TP-DBP的体外降解率。(三)Mg@TP-DBP大鼠皮下包埋模型的建立1、构建大鼠皮下包埋牛心包模型,于术后7、14、28和56天取出组织标本和重要脏器,用福尔马林固定后制成病理切片。2、通过HE、VB染色对Mg@TP-Dbiofortified eggsBP进行组织学水平的评价。3、通过茜素红染色和钙定量检测对Mg@TP-DBP进行钙化的评估。4、对各个重要器官进行HE染色评估Mg@TP-DBP的体内组织相容性。(四)Mg@TP-DBP的抗钙化研究使用免疫组织化学染色法检测成骨标志物Runt相关转录因子(RUNX2)和巨噬细胞标志物CD68、CD86、CD163的表达。结果:(一)在成功制备出DBP基础上,进一步构建出Mg@TP-DBP组织学染色结果和扫描电镜结果显示,真空冻融法制备出的DBP有效去除了细胞成分,并形成了多孔互连的微观结构。厚度、极限载荷、杨氏模量、极限抗拉强度和含水量的测量结果提示脱细胞过程没有影响牛心包的天然力学性能。观察不同浓度Mg@TP交联后牛心包的颜色和形态,无明显差别。使用L929细胞进行CCK-8实验,确定了≤3.0mg/ml的Mg~(2+)是最佳处理浓度。离子释放率检测实验结果提示,同一时间点p H越低,Mg~(2+)的释放量越多。(二)Mg@TP-DBP的生物相容性、物理性能及交联特性的评价CCK-8和流式细胞术结果表明≤2.0mg/ml的Mg~(2+)制备出的Mg@TP-DBP无明显人源性细胞毒性,溶血实验结果提示Mg@TP-DBP对体外溶血没有影响,证明Mg@TP-DBP的生物相容性良好。厚度和吸水率检测结果提示Mg@TP交联处理能有效改善DBP的物理性能;通过透射电子显微镜可以观察到,Mg@TP-DBP的内部有Mg@TP纳米颗粒形成。茚三酮检测法结果提示Mg@TP-DBP的交联度与Glut-DBP无明显差异;体外降解实验结果提示Mg@TP-DBP降解率与Glut-DBP无明显差异。(三)Mg@TP-DBP大鼠皮下包埋实验通过大鼠皮下包埋模型对Mg@TP-DBP进行相关体内检测。组织学染色结果可以看出,随着包埋时间的延长,Mg@TP-DBP周围有大量宿主细胞浸润,有宿主胶原再生。茜素红染色和钙定量结果提示Mg@TP-DBP出现钙结节的时间晚于Glut-DBP,从约28天开始出现可见钙结节,且同一时间点下的钙化程度较低。(四)Mg@TP-DBP的抗钙化研究免疫组化染色结果显示,Mg@TP-DBP在各时期的成骨标志物RUNX2均低于Glut-DBP;虽然Mg@TP-DBP各个时期均有不同程度的CD68巨噬细胞标志物表达,但同一时间节点下的表达量低于Glut-DBP;根据CD86/CD163比值量化M1/M2巨噬细胞的比例,发现Mg@TP-DBP的CD86/CD163比值低于同一时期下的Glut-DBP。结论:本课题制备出的Mg@TP-DBP生物相容性良好,无明显细胞毒性和致溶血的潜在危险,物理性能和交联特性均不亚于传统的Glut-DBP。大鼠皮下包埋动物实验结果表明,Mg@TP-DBP的抗钙化性能显著优于Glut-DBP,其可能是通过调控巨噬细胞极化影响炎症的发生发展从而发挥减缓钙化的作用。