背景食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)为消化道恶性肿瘤,是全球第六大常见癌症死亡原因。中国最常见的食管癌病理分型为ESCC,拥有全球一半数量的食管鳞癌患者。ESCC具有比较高的发病率和死亡率,ESCC早期症状不明显,大多数患者确诊时已处于晚期,五年生存率仅有20%左右。因此,探究食管鳞癌的发生发展机制,寻求新的特异性生物标志物,对于ESCC患者的早期诊断、个体化治疗和预后预测尤为重要。微小RNA(miRNAs)是一组高度保守的内源性非编码小RNA,广泛存在于真核生物中,具有组织特异性,参与调控人体多种病理生理过程。研究表明,miRNAs参与多种肿瘤的发生发展,在癌细胞的侵袭、转移和血管生成过程中起到促进或抑制作用。前期研究显示miR-149-3p在食管鳞癌组织中低表达,但是miR-149-3p在食管鳞癌组织中的作用和机制尚不明确。Apelin是目前已知的APJ受体的唯一内源性配体,属于G蛋白偶联受体家族的成员之一。Apelin和APJ广泛分布于体内,有研究发现Apelin在肿瘤组织中过度表达,且能够促进肿瘤细胞增殖、转移和血管生成,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。因此,Apelin有望作为一种生物标志物,用于癌症的早期诊断、治疗和预后监测。但是Apelin在食管鳞癌的发生发展中的作用,以及作用机制并不完全清楚。目的本课题结合临床食管鳞癌组织样本和食管鳞癌ECA109和ECA9706细胞系,探索miR-149-3p在ESCC细胞增殖与凋亡、转移及侵袭等方面的作用机制,明确Apelin是否为miR-149-3p的作用靶点。为研究食管鳞癌的病因以及发展过程提供新的理论依据,为其临床防治提供新的研究方向和治疗靶点。方法1.检测miR-149-3p和Apelin在食管鳞癌组织以及癌旁组织中的表达。取食管鳞癌病人组织样本,通过qRT-PCR和免疫组化检测miR-149-3p和Apelin在癌组织和癌旁组织中的表达量。2.利用miRNA生物信息技术和双荧光素酶报告基因检测Apelin是否是miR-149-3p的靶基因。对ECA109和ECA9706细胞转染NC和miR-149-3p模拟物,使用qRT-PCR、Talazoparib临床试验Western blot和免疫荧光检测miR-149-3p、Apelin mRNA和蛋白的表达水平。3.ECA109和ECA9706细胞转染NC和miR-149-3p模拟物,通过细胞流式仪检测食管鳞癌细胞周期阻滞情况,集落克隆实验检测食管鳞癌细胞系的集落形成能力。使用免疫荧光、qRT-PCR和Western blot检测PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平。4.ECA109和ECA9706细胞转染NC和miR-149-3p模拟物后,通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力。使用鬼笔环肽染色来观Biofouling layer察细胞骨架微管微丝以及细胞形态的变化情况。通过Western blot和qRT-PCR检测与食管鳞癌侵袭相关的MMP9蛋白和mRNA的表达水平。5.通过流式细胞仪和Western blot检测凋亡蛋白相关的表达检测。通过Tunel染色在倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。6.体内实验:对食管鳞癌细胞ECA109转染NC和miR-149-3p模拟物后在裸鼠腋下荷瘤,观察肿瘤生长总体情况。Western blot和qRT-PCR检测肿瘤Apelin、MMP9、PCNA mRNA和相关蛋白表达。结果1.人食管鳞癌组织标本免疫组化染色结果显示,与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中棕色颗粒沉积增多,Apelin表达显著升高。qRT-PCR结果表明,与癌旁组织相比,食管鳞癌组织中Apelin mRNA的表达量显著提高,提示Apelin在肿瘤组织中高表达。2.(1)双荧光素酶报告基因实验结果表明,与突变组相比,miR-149-3p可以调控野生型Apelin 3’-UTR区域,从而抑制Apelin的表达。(2)在食管鳞癌细胞系ECA109和ECA9706中转染miR-149-3p模拟物和NC,qRT-PCR和Western blot结果3-Methyladenine显示,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物的ECA9706组中显著升高约30倍,ECA109 miR-149-3p mRNA表达量显著升高约400倍,Apelin mRNA和蛋白的表达水平则显著下调,提示miR-149-3p与Apelin存在负调控。免疫荧光结果表明,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物后细胞的Apelin荧光信号变弱。这些结果提示miR-149-3p与Apelin之间存在负调控作用。3.集落克隆实验结果表明,与对照组相比,过表达miR-149-3p模拟物后集落克隆形成数量减少,细胞周期被阻滞在G0/G1期,细胞的增殖复制能力变弱。qRT-PCR和Western blot结果表明,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物后显著降低PCNA、Cyclin D1、Ki67 mRNA和蛋白表达水平,细胞免疫荧光信号减弱,蛋白表达减少。这些结果提示miR-149-3p可以抑制食管鳞癌细胞增殖。4.探究过表达miR-149-3p后是否会抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。细胞划痕实验结果显示,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物后细胞向中间的迁移能力明显变弱,细胞穿过Transwell小室基质胶的数量减少,鬼笔环肽染色显示细胞骨架变小,细胞的微管微丝分布减少,荧光信号变弱。qRT-PCR、Western blot和免疫荧光结果表明,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物后MMP9 mRNA和蛋白水平降低,荧光信号减弱。这些结果提示过表达miR-149-3p会抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。5.在食管鳞癌细胞系ECA109和ECA9706中转染miR-149-3p模拟物和NC后流式细胞术检测细胞凋亡结果表明,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物组细胞早凋和晚凋都增加,Western blot实验结果显示cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白表达明显增加,细胞Tunel染色荧光强度和数量明显增加,这些结果提示转染miR-149-3p模拟物后促进食管鳞癌细胞凋亡。6.体内实验结果表明,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物后细胞的肿瘤体积明显较小,qRT-PCR结果显示Ki67、Cyclin D1、MMP9、PCNA mRNA和表达水平降低,Western blot和免疫组织化学染色显示,与对照组相比,转染miR-149-3p模拟物组Apelin、PCNA、MMP9的蛋白水平降低,Apelin、Cyclin D1和Ki67棕色颗粒沉积都明显减少。这些结果提示经过miR-149-3p预处理的细胞在体内可以起到抑制肿瘤生长的作用。结论1.在体外,过表达miR-149-3p抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。2.在体内,过表达miR-149-3p抑制食管鳞癌细胞肿瘤生长。3.miR-149-3p和Apelin的表达呈负相关性,miR-149-3p可以直接靶向Apelin,为食管鳞癌临床治疗提供理论依据。