因人口老龄化、环境污染和生活方式等因素的影响,肿瘤发病率不断上升,已经成为威胁人类健康和生命的重要原因之一。近年来,mRNA纳米疫苗的兴起为肿瘤的免疫治疗提供了新的方向。与传统化疗药物相比,mRNA纳米疫苗具有高效、特异且安全等优点。它不仅可以诱导CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞等免疫细胞的激活和增殖,还可以针对特定靶标,通过T细胞介导的细胞毒作用杀死肿瘤细胞,从而增强肿瘤免疫治疗的效果。然而,由于mRNA极不稳定,在体内外易被核酸酶降解,因此,需要使用一种有效的递送载体才能将其转运至细胞内部。目前商品化mRNA疫苗的递送主要是基于脂质体纳米粒(Lipid Nanoparticles,LNP)展开的,这种类型的递送载体虽然能够提高mRNA的递送效率,但是由于制备复杂且需要严格的存储条件,一定程度上限制了其广泛应用。本课题拟选取MUC1-VNTR基因序列作为肿瘤相关性抗原,结合我们课题组前期开发的双佐剂自载体纳米体系,以期制ABT-263 IC50备一种高效的mRNA肿瘤纳米疫苗(mMUC1 NPs),为胰腺导管癌的治疗提供一种新方法。我们设计并扩增含有MUC1基因的质粒DNA,并通过体外转录合成mRNA,再以佐剂单磷酰脂质A(Monophosphatidyl A,MPLA)和富含CpG的寡核苷酸(CpGODN)作为载体材料,采用分子自组装技术将mRNA包裹其中制成mRNA纳米疫苗。在理化性质表征中,我们对其粒径、电位、表面形貌、包封率和体外稳定性进行了研究。在体外实验中,我们主要探讨了 mMUC1 NPs的细胞毒性以及诱导树突状细胞(Dendritic cells,DCs)摄取、成熟和活化的能力,并通过免疫蛋白印迹分析了 mMUC1 NPs在体内的表达时间。在体内实验中,我们以VX-445研究购买小鼠MUC1阳性(MUC1+)胰腺导管癌为肿瘤模型,评估了该纳米疫苗的抗肿瘤效果,并通过分析小鼠的全身和肿瘤局部的免疫状态,进一步探讨其抗肿瘤免疫机制。体外表征结果证明我们通过体外转录成功合成了 mRNA,并将其有效包载至双佐剂自载体球型纳米颗粒中,该纳米疫苗粒径大小均一(160.53±3.90nm)且分散性良好(0.20±0.009),可在水溶液中稳定存在35天以上。体外细胞实验证实,mMUC1 NPs没有明显的细胞毒性,且易被DCs有效摄取并翻译成蛋白质。与小鼠骨髓来源的树突状细胞共孵育后,mMUC1 NPs可显著刺激主刺激分子MHBiosensing strategiesC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,并刺激细胞因子如IFN-γ、TNF-α的分泌,表明mMUC1 NPs可促进DCs的成熟与活化,起始免疫反应。另外,我们发现虽然不同储存条件对mMUC1 NPs的影响不大,但长期储存时,4℃效果最好。体内抗肿瘤试验结果表明,相比目前临床上的一线治疗方案,mMUC1 NPs能够显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长并延长其生存期,而且,该纳米疫苗与化疗药或PD-1抗体联用时均能发挥免疫协同治疗作用,尤其是与PD-1抗体联用时,抑瘤效果更加显著,约30%的荷瘤小鼠的肿瘤完全消退,83%的小鼠实现了长期带瘤生存。在免疫机制研究中,mMUC1 NPs或与化疗药或PD-1抗体联用时,可以显著刺激荷瘤小鼠淋巴结、脾脏和肿瘤中CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖与活化,并下调脾脏和肿瘤中调节性 T 细胞(Regulatory T cells,Tregs)的比例。同时,mMUC1 NPs 与 PD-1 抗体联用可以促进肿瘤微环境中的NK细胞增殖,并分泌趋化因子XCL1来招募DCs,从而提高肿瘤微环境中浸润淋巴细胞的比例,实现对肿瘤的特异性杀伤。此外,mMUC1 NPs与化疗药或PD-1抗体联用可以促进细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌诱导记忆性CD4+T细胞的增殖,实现长期免疫记忆,有效阻止肿瘤的转移与复发。综上所述,采用双佐剂自载体负载肿瘤抗原特异性mRNA构建mRNA肿瘤纳米疫苗,可激发机体产生高效的抗肿瘤免疫反应,是一种具有广阔应用前景的抗肿瘤免疫手段。