背景与目的:肝细胞癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均位居世界前5位。肝细胞癌病死率高的原因除了早期无明显症状导致患者不能及时就诊从而延误诊断和治疗外,肝癌细胞自身分裂增殖能力较强并且调节性细胞死亡能力降低,这导致肝癌细胞肝内快速转移和扩散。近年来的研究发现有丝分裂灾难是一种固有的肿瘤抑制机制,作为调节性细胞死亡的前驱,可以导致肿瘤细胞死亡或衰老。因此,诱导肿瘤细胞有丝分裂灾难是癌症治疗中十分有潜力的治疗策略。有丝分裂灾难发生的关键在于有丝分裂期间细胞染色体不能合适地分配到子细胞中,而调控这一过程的关键元件是着丝粒动粒复合体。着丝粒蛋白A(centromere protein A,CENPA)作为着丝粒动粒复合体的核心分子,调控着丝粒与动粒的组装和对接,从而保证染色体正确分配,有助于有丝分Emricasan试剂裂顺利进行。因此,本研究拟探索CENPA差异表达是否引起肝癌细胞有丝分裂灾难及其调控机制。内容和方法:一、CENPA的表达水平和肝癌细胞有丝分裂灾难相关性1.CENPA在肝细胞癌中的表达情况及其对肝细胞癌患者临床生存和分期的影响:(1)从本院收集20例原发性肝细胞癌患者的癌和癌旁组织,q PCR检测CENPA m RNA的表达情况。(2)q PCR检测肝癌细胞(Huh-7,SMC-7721PCI-32765,Hep G2)和正常肝细胞(HL-7702)中CENPA m RNA的表达情况。(3)使用R studio软件对TCGA数据库中360例肝细胞癌患者的CENPA表达水平与肝癌患者的10年总生存率、无病生存率和临床分期进行相关分析。2.CENPA的差异表达对肝癌细胞有丝分裂灾难的影响:(1)使用Sh RNA慢性毒载体构建CENPA敲低的细胞模型,使用Western Blot及Organic immunityq PCR检测转染和对照组CENPA表达水平,以明确细胞模型是否构建成功。(2)检测抑制CENPA表达后,肝癌细胞是否发生有丝分裂灾难:通过细胞免疫荧光实验检测肝癌细胞有丝分裂过程中纺锤体和染色体的分布情况;通过细胞周期实验检测肝癌细胞的周期进程;使用凋亡实验检测肝癌细胞凋亡的情况;通过EDU实验检测肝癌细胞的分裂能力;通过CCK8实验评估肝癌细胞的增殖能力。二、探索CENPA的转录因子及其对肝癌细胞有丝分裂灾难的影响1.筛选CENPA的转录因子:(1)在NCBI网站上查询CENPA基因转录起始位点上游2000bp到下游200bp碱基序列作为启动子序列,通过UCSC网站预测可能与该序列结合的转录因子。(2)使用TCGA数据对预测转录因子的表达量与CENPA的表达量进行相关性分析来进一步筛选。2.筛选出的转录因子(MYBL2,MYB proto-oncogene like 2,成髓细胞瘤转录因子2)在肝细胞癌中的表达情况及其对肝细胞癌患者生存率和临床分期的影响:(1)从本院收集20例原发性肝细胞癌患者的癌和癌旁组织,q PCR检测MYBL2 m RNA的表达情况。(2)q PCR检测肝癌细胞(Huh-7,SMC-7721,Hep G2)和正常肝细胞(HL-7702)中MYBL2 m RNA的表达情况。(3)使用R studio软件对TCGA数据库中364例肝细胞癌患者的MYBL2表达水平与肝癌患者的10年总生存率、无病生存率和临床分期进行相关分析。3.MYBL2的差异表达对肝癌细胞CENPA m RNA水平和有丝分裂灾难的影响:(1)使用Si RNA构建MYBL2敲低的细胞模型,使用Western Blot及q PCR检测MYBL2敲低组和对照组MYBL2的蛋白和m RNA表达水平,以明确细胞模型是否构建成功;再使用q PCR检测CENPA m RNA的表达水平。(2)检测抑制MYBL2表达后,肝癌细胞是否发生有丝分裂灾难(具体方法同前)。三、探索CENPA的转录因子对肝癌细胞有丝分裂灾难的作用机制1.MYBL2对CENPA的调控机制:(1)使用JASPAR网站预测MYBL2在CENPA基因启动子上的结合位点;(2)通过染色质免疫共沉淀实验(CHIP)检测MYBL2是否结合于CENPA基因启动子的预测位点;(3)通过双荧光素酶报告基因实验,构建包含CENPA基因启动子预测位点突变体的萤火虫荧光素酶报告基因载体,探究MYBL2是否通过结合于预测位点对CENPA基因起到转录激活作用。2.MYBL2是否通过CENPA调控有丝分裂灾难:(1)使用MYBL2 Si RNA和CENPA过表达质粒构建如下分组细胞模型:对照组、MYBL2敲低组、MYBL2敲低+CENPA过表达组,检测各组肝癌细胞MYBL2和CENPA的表达水平(Western Blot)以及有丝分裂灾难的发生情况(方法同前)。结果:一、CENPA的表达水平和肝癌细胞有丝分裂灾难的相关性1、CENPA在肝细胞癌中表达升高且与临床不良预后相关:CENPA m RNA在肝细胞癌组织中表达相比于癌旁肝组织升高;与正常肝细胞相比,肝癌细胞中CENPA m RNA表达升高。肝细胞癌患者中CENPA高表达组相对于低表达组10年总存活率和无病生存率较差,且随患者临床分期增高。2、当抑制CENPA表达后,肝癌细胞发生有丝分裂灾难:有丝分裂过程中染色体不能均匀分布到子细胞中;肝癌细胞在G2/M期比例增加;肝癌细胞凋亡比例增加;有效分裂的肝癌细胞比例降低;且增殖能力减弱。二、MYBL2正向调控CENPA且参与肝癌细胞有丝分裂灾难1、CENPA预测到的转录因子为MYBL2。2、MYBL2在肝细胞癌中表达升高且与临床不良预后相关:相比于癌旁肝组织,MYBL2 m RNA在肝细胞癌组织中表达升高;与正常肝细胞性比,肝癌细胞中MYBL2 m RNA表达升高。肝细胞癌患者中MYBL2高表达组相对于低表达组10年总存活率和无病生存率较差,且随患者临床分期增高。3、抑制MYBL2表达后,肝癌细胞CENPA m RNA表达下调且发生有丝分裂灾难:有丝分裂过程中染色体不能均匀分布到子细胞中;肝癌细胞在G2/M期比例增加;肝癌细胞凋亡比例增加;有效分裂的肝癌细胞比例降低;且增殖能力减弱。三、MYBL2结合于CENPA基因启动子-1055/-1041位点转录激活CENPA参与肝癌细胞有丝分裂灾难1、MYBL2转录激活CENPA:(1)使用JASPAR网站预测MYBL2在CENPA基因启动子上的结合位点为-1055/-1041位点(2)CHIP-PCR结果表明MYBL2阳性结合于CENPA启动子的-1055/-1041位点。(3)双荧光素酶报告基因实验结果表明相比于使用MYBL2结合位点突变体启动子序列的萤火虫荧光素酶报告基因质粒转染的肝癌细胞,具有MYBL2结合位点的野生型萤火虫荧光素酶报告基因质粒转染的肝癌细胞中,萤火虫荧光素酶的活性较高,而MYBL2过表达组的萤火虫荧光素酶的活性进一步加强。2、MYBL2通过调节CENPA表达调控肝癌细胞有丝分裂灾难:相比于对照组,MYBL2敲低组和MYBL2敲低+CENPA过表达组MYBL2表达水平下调;相比于对照组,MYBL2敲低组CENPA表达水平下调,且肝癌细胞发生有丝分裂灾难,但在MYBL2敲低+CENPA过表达组CENPA表达水平恢复。且肝癌细胞有丝分裂灾难情况缓解。结论:1、肝癌细胞CENPA异常表达抵抗有丝分裂灾难发生。2、MYBL2正向调控CENPA m RNA水平且参与肝癌细胞有丝分裂灾难。3、MYBL2结合于CENPA基因启动子-1055/-1041位点转录激活CENPA参与肝癌细胞有丝分裂灾难。总结:MYBL2通过结合于CENPA基因启动子-1055/-1041位点激活CENPA的转录来抵抗肝癌细胞发生有丝分裂灾难。