achr抑制剂

目的:评估结直肠癌患者KRAS、NRAS和BRAF的基因突变状态、临床病理特征和预后价值,为结直肠癌患者的基因检测策略提供理论依据。方法:回顾Puromycin体内实验剂量性分析2017年1月1日至2020年12月1日期间在吉林大学第二医院结直肠外科接受手术治疗的患者数据。收集临床信息Indirect genetic effects包括性别、年龄、病理免疫组化结果,肿瘤组织学、淋巴血管浸润、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度、肿瘤分型、肿瘤TNM分期等。由吉大二院病理科专家基于UICC/AJCC第8版的TNM肿瘤分期标准评定病理特征和临床分期。在吉大二院精准医学中心使用突变阻Etoposide体内滞扩增系统PCR(ARMS-PCR)技术检测KRAS基因、BRAF基因和NRAS突变的突变状态。使用统计学分析KRAS、NRAS和BRAF基因突变的临床病理特征以及预后价值。结果:(1).KRAS基因突变占全部结直肠癌患者的40.2%(68/169),其中突变率相对较高的是G12D(15.4%)、G12V(9.4%)和G13D(8.8%)。BRAF V600E突变率为4.7%(8/169)。(2).临床病理相关性分析显示,KRAS突变患者相较于KRAS野生型患者有着更高的神经浸润和粘液腺癌比例(P<0.05);KRAS突变亚型G12D、G12V和G13D之间的临床病理特征没有差异。(3).NRAS与临床病理特征没有显著相关性。(4).BRAF基因突变与右半结肠癌,N分期更高,更高的脉管浸润率相关(P<0.05)。(5).预后分析表明KRAS基因突变的结直肠癌患者预后更差(P<0.005)。(6).多变量Cox回归分析显示,KRAS突变、患者性别以及患者年龄大小和肿瘤部位是结直肠癌患者预后的独立预后因素(P<0.05)。结论:(1)KRAS基因突变型率为40.2%,BRAF和NRAS的突变率为4.7%。(2)KRAS突变的位点中,突变率相对较高的是G12D(15.4%)、G12V(9.4%)和G13D(8.8%)。(3)NRAS突变位点中,3号外显子上的Q61R(2.2%)突变率最高。(4)肿瘤神经浸润,粘液腺癌与KRAS突变率显著相关。右半结肠癌与BRAF突变显著相关。NRAS与临床病理特征没有显著相关性。(5)生存分析显示,KRAS是CRC患者的不良预后因素。性别,年龄,肿瘤部位和KRAS状态是与患者预后相关的独立风险因素。

目的:太原市于2010年建立了HFMD监测系统,为了解有关HFMD流行病学特征以及柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CVA16)的遗传特征,我们研究了2010-2021年中国山西省太原市HFMD的流行病学和CVA16的遗传特征。通过研究,我们可以了解太原市HFMD的流行情况,增加全球范围内CVA16的可用遗传资源,为Dolutegravir分子量HFMD的预防、控制及疫苗研发提供科学依据。方法:1.太原市不同区县的10家医院采集发病后3天内临床诊断的HFMD病例,每个月至少采集5份样本,样本类型为咽拭子或粪便,按照生物安全管理条例由各区县疾病预防控制中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)将样本送至太原市CDC微生物检验科。2010-2021年共采集6641份样本,送往太原市CDC微生物检验科进行肠道病毒核酸检测。2010-2021年太原市HFMD流行病学资料来源于中国疾病预防控制信息系统,使用Excel、SPSS软件进行统计分析。2.对收集的样本进行肠道病毒RNA提取,使用三通道实时荧光定量PCR肠道病毒检测试剂盒进行核酸检测,对CVA16病毒核酸阳性的样本,扩增VP1基因全长序列并进行测序。3.对测序所获得的核苷酸序列使用Sequencher(5.4.6)软件进行拼接和比对;使用Bio Edit(7.2.5)软件对核苷酸和氨基酸的同源性进行分析。采用MEGA(11.0.11)软件对太原市CVA16毒株的VP1序列与国内外参考毒株序列进行比对分析,构建系统发育树采用邻接法(neighbor-joining),分析CVA16的基因特征。结果:1.2010年1月1日至2021年12月31日,太原市共报告HFMD 71158例。HFMD的年平均发病率为123.69例/10万人(20.68-219.25/10万人)。大多数HFMD病例发生在1至5岁年龄组84.42%(60075/71158)。男性HFMD的发病率(144.41/10万人)明显高于女性(101.20/10万人)(χ~2=22188.249,P<0.001),平均男女性别比为1.47:1。2.除2020年受新冠SAG小鼠肺炎疫情影响外,HFMD病例月分布呈现两次疫情高峰;一个高峰在5月至8月,另一个高峰在10月至12月。HFMD病例峰值出现了明显的变化,2016年(包括)之前的高峰在6月,到2017年以后转移至7月。在新冠肺炎流行期间,仅在2020年10月至12月出现HFMD疫情高峰,占全年病例的74.33%。3.6641份样本中共检测到4236份EV阳性样本,其中EV-A71 988份(23.32%)、CVA16 1488份(35.13%)、其他肠道病毒1760份(41.55%)。4.太原市CVA16毒株属于B基因型中的B1基因亚型,并处于两个不同的进化分支,分别为B1a、B1b。在所有毒株中,184株为B1b,38株为B1a。184株B1b毒株主要处于两个不同的传播链,一个流行于2012年至2019年,另一个流行在2016年至2021年,而38株B1a毒株在2010年至2015年和2019年至2021年流行。5.太原市CVA16核苷酸同源性为86.5%-100%,氨基酸同源性为96.9%-100%;太原市CVA16毒株与原型株(G10/RSA/1951)在核苷酸和氨基酸序列上的同源性分别为74.2-77.2%和90.9-92.2%。184株B1b CVA16在核苷酸和氨基酸序列上同源性分别为90.6-99.8%和97.9-100%。38株B1a CVA16毒株在核苷酸和氨基酸序列上分别具有90.5-99.8%和97.6-100%的同源性。结论:太原市12年(2010-2021年)HFMD病例监测数据显示,HFMD感染人群中,男性患病人数明显高于女性,1-5岁的儿童占大多数。HFMD病例全年均有报告,但呈明显的季节性,高发病区主要在小店区、万柏林区、杏花岭区。根据太原市HFMD的流行特征,需针对高危地区,在高发时间前提前做好预防工作,减少HFMD的流行。HFMD的病原体谱发生了一定程度的变化,由EV-A71引起的HFMD病例数量逐渐减少;但是,CVA16仍然流行,并已成为太原市引起HFMD的最重要病原体之一。在太原市发现的所有CVA16毒株都属于B基因型,B1亚基因型,分属于两个进化支B1a和B1b。因此实验室应扩大肠道病毒病原型别medical dermatology监测范围,并有针对性的进行病原检测,为太原市HFMD防治工作提供科学依据。

背景:随着社会的高速发展和各种高压事件的频发,抑郁症逐渐成为全球范围内最为普遍的精神障碍类疾病。抑郁症以长期的情绪低落、快感缺失和行为绝望为主要特征,但目前临床使用的一线抗抑郁药物治疗效果不佳,患者停药后易复发,这些现状提示抑郁症具有多病因机制的显著特点。因此,目前亟需更全面地阐明抑郁症的病理机制,以寻找治疗抑郁症的新靶点,并针对性地开发更优化的诊断和治疗策略。近年研究表明,神经元可塑性失调在抑郁症的发生发展中可能起着重要作用。慢性、持续的压力应激往往导致大脑出现适应性异常,神经元发生结构和功能可塑性损伤,从而影响正常的神经放电、神经内分泌等活动,这可能是促进抑郁、焦虑等情绪障碍发生的重要诱因,但具体机制不清。细胞内酸碱平衡是细胞维持功能活动稳态的重要特征之一,但截至目前止,神经元细胞内酸碱稳态失衡在抑郁症发病中的作用及机制尚不清楚。Na+/H+交换体(Na+/H+exchanger,NHE)属于高度进化保守的转运蛋白家族,可将细胞内H+与胞外Na+进行电中性交换,调控细胞内pH值(intracellular pH,pHi)的动态平衡。其中,NHE1是中枢神经系统中表达最丰富的亚型,尤其在皮质、海马和小脑中高表达,是哺乳动物神经元细胞内酸碱稳态的主要调节者,但其在突触可塑性调节中的作用,及其异常表达是否参与抑郁症的发病过程,目前尚未可知。在此研究背景下,我们拟构建慢性不可预知温和应激(Chronic Unpredicted Mild Stress,CUMS)诱导的抑郁动物模型,并采用蛋白质组学、膜片钳电生理、行为学检测、化学遗传学、病毒学和转基因鼠结合等多种实验技术与方法,探究压力应激作用下,NHE1是否通过调节神经元突触可塑性参与抑郁症的发生发展,及其发挥作用的具体分子机制。方法:(1)在体CUMS建模:将雄性Wistar大鼠(120-140 g)随机分为Control(空白对照组,Ctrl)组和CUMS组,给予CUMS组大鼠5周的慢性不可预知温和应激。造模结束后,对两组大鼠进行行为学测试以评估大鼠抑郁样和焦虑样行为,包括蔗糖偏好实验、强迫游泳实验、旷场实验和高架十字迷宫实验;采用H+荧光探针检测神经元细胞内pH值水平;采用免疫荧光、高尔基染色、透射电镜检测神经元结构可塑性如树突棘、突触的形态数目变化等;采用脑片膜片钳技术检测神经元功能性放电活动。对Control组大鼠和行为学测试中表现出抑郁样行为的CUMS组大鼠海马组织样本进行Label-free定量蛋白质组学检测,通过生物信息学分析寻找与调节细胞内pH值有关的差异性表达蛋白质。(2)敲减NHE1的腺相关病毒脑内注射建模:构建特异性敲减兴奋性神经元中NHE1的腺相关病毒,利用脑立体定位仪注射于大鼠的双侧海马CA1(Cornu Ammonis 1)区,病毒感染2-3周后进行蔗糖偏好实验、强迫游泳实验等行为学检测,若无显著的抑郁样行为,则给予大鼠2周的慢性不可预知温和应激刺激;通过Western blot技术、免疫荧光、转盘式共聚焦、高尔基染色、全细胞膜片钳技术和电子显微镜分别观察NHE1蛋白的表达水平、细胞定位、细胞内pH值以及神经元结构和放电活动的改变。采用全转录组学测序和qPCR技术验证NHE1的mRNA表达水平;通过富集分析寻找调控翻译后修饰相关的蛋白质,进一步利用定量蛋白组学结果和生物信息学分析寻找与调控NHE1蛋白表达水平相关的差异性表达蛋白质。(3)离体实验建模:培养原代大鼠海马神经元,构建皮质LEE011体内酮(Corticosterone,CORT)诱导的细胞应激模型,验证应激刺激作用下NHE1蛋白的降解途径:采用溶酶体抑制剂氯喹阻断溶酶体降解通路,采用蛋白酶体抑制剂MG132阻断蛋白酶体降解通路;利用免疫荧光技术观察NHE1和CUL4A(Cullin4A)在神经元中的定位;采用免疫沉淀技术验证应激刺激作用下NHE1的泛素化水平。(4)构建过表达CUL4A的腺相关病毒,并通过脑立体定位仪定位注射于Thy1-Cre小鼠双侧海马CA1区,病毒感染2-3周后,对各组动物进行蔗糖偏好实验和强迫游泳实验等行为学测试;采用H+荧光探针和转盘式共聚焦检测小鼠海马CA1区神经元内pH值变化;通过Western blot技术检测CUL4A和NHE1的蛋白表达水平;使用膜片钳技术检测神经元自发性放电及诱发的动作电位变化。(5)基于化学遗传学技术,构建AAV-DIO-hM4Di-mCheery病毒,通过脑立体定位仪定点注射于Thy1-Cre小鼠海马CA1区;构建AAV-CaMKII-hM4Di-mCheery病毒注射于正常大鼠的海马CA1区,病毒感染2-3周后,对动物进行腹腔注射生理盐水或者CNO(clozapine-N-oxide)处理,通过蔗糖偏好实验和强迫游泳实验检测行为学改变;采用脑片膜片钳技术检测CNO给药前后神经元的兴奋性变化。结果:(1)与Control组比较,CUMS组大鼠在蔗糖偏好实验中对糖水的消耗百分比明显降低;在强迫游泳实验中其保持不动、相对静止的时间显著增多;在旷场实验中运动的总距离没有明显差异,但与Control组比较,CUMS组大鼠在中央格停留的时间减少;在高架十字迷宫实验中,与Control组比较,CUMS组点击此处大鼠进出开放臂的次数以及停留在开放臂的总时间均明显减少。与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元内pH值显著降低;CUMS组大鼠海马CA1区神经元的树突复杂性、树突棘密度和突触数量均有一定程度的降低;与Control组比较,CUMS组大鼠海马CA1区神经元自发性兴奋性突触后电流和微小兴奋性突触后电流减弱。以上结果提示5周的慢性不可预知温和应激可诱导大鼠表现出抑郁样行为,降低神经元内pH值水平并导致海马神经元结构和功能可塑性异常。(2)蛋白质组学结果显示,多种蛋白质在抑郁样大鼠海马CA1区存在差异性表达,其中NHE1蛋白表达明显减少,提示NHE1可能是参与抑郁症发病中神经元胞内pH值降低和可塑性损伤的关键分子。(3)行为学检测结果显示,相比于注射对照病毒组,敲减正常大鼠海马CA1区NHE1的蛋白表达后,动物的行为学检测结果无显著性变化,但给予这组大鼠仅2周的CUMS刺激,就足以诱导明显的抑郁样行为,包括在蔗糖偏好实验中饮用糖水的百分比减少,在强迫游泳实验中呈现静止状态的时间显著增加等。以上结果提示,相比于注射对照病毒组,敲减大鼠海马CA1区NHE1蛋白表达使大鼠在受到压力应激刺激后更容易表现出抑郁样行为,对应激刺激的易感性增加。(4)QPCR结果显示,Control组和CUMS组间NHE1的mRNA表达水平无统计学意义,提示NHE1蛋白水平下调可能是由于转录后或翻译后调控所致。COG(Cluster oforthologous group)富集分析显示,抑郁大鼠海马CA1区呈差异性表达的蛋白质主要富集在蛋白质翻译后修饰途径。在富集于翻译后修饰通路的差异性蛋白质中,CUL4A作为可通过泛素化降解蛋白质的E3泛素连接酶家族重要成员,与Control组比较,其在CUMS组表达水平明显增高。Western blot技术检测发现,经蛋白酶体抑制剂MG132处理后,可明显逆转CORT诱导的NHE1表达水平的下调,说明应激刺激作用下NHE1蛋白水平的下调可能与蛋白酶体降解途径有关。免疫荧光结果显示CUL4A和NHE1在内质网上存在共定位现象。免疫沉淀结果表明,随着CORT作用时间增加Collagen biology & diseases of collagen,培养的原代神经元中NHE1泛素化水平明显升高。这些结果提示CUL4A可能靶向NHE1的泛素化修饰,并促进其通过蛋白酶体途径降解。(5)在Thy1-Cre小鼠海马CA1区锥体神经元中过表达CUL4A,给予小鼠2周的CUMS刺激,即可诱导其产生明显的抑郁样行为。同时发现,相比于注射对照病毒组,过表达CUL4A的小鼠CA1区谷氨酸合成酶活性下降,锥体神经元内pH值降低,神经元自发性放电及诱发的动作电位明显减少,并伴随NHE1蛋白表达水平降低。(6)脑片膜片钳全细胞记录结果发现,在新鲜的脑切片灌流液中加入CNO后,表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠海马椎体神经元产生动作电位的诱发电流阈值增高,神经元兴奋性降低;相比于CNO给药前,在相同的注入电流诱发条件下,表达hM4Di的大鼠兴奋性神经元动作电位频率降低。行为学检测结果发现,在锥体神经元中特异性表达hM4Di的Thy1-Cre小鼠中,相比于生理盐水注射组,腹腔注射CNO组小鼠在在强迫游泳实验和悬尾实验中的静止时间均增多。同样,在兴奋性神经元中特异性表达hM4Di的大鼠中,相比于腹腔注射生理盐水组,腹腔注射CNO的大鼠在强迫游泳实验中静止不动时间增多,在蔗糖偏好实验中糖水消耗百分比减少,表现出抑郁样行为。结论:慢性压力应激可导致大鼠海马CA1区E3泛素连接酶CUL4A表达增加,CUL4A可能通过泛素化修饰NHE1使其降解增加,导致神经元内H+排出减少、pH值降低,细胞内酸碱稳态失衡,继而导致海马CA1区锥体神经元突触可塑性发生失调,突触传递效能减弱,神经元兴奋性降低,并最终促进动物产生抑郁样行为。本研究结果完善了压力应激刺激导致抑郁症发病的神经可塑性损伤机制,为发现和筛选新型抗抑郁药和抗抑郁治疗新策略提供潜在靶点和科学依据。

背景原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全世界最严重的的恶性肿瘤之一,具有发病率高、死亡率高、难以根治、预后差等特点,严重危害人类健康。化疗作为传统肿瘤治疗方法,在抑制肿瘤生长,延长患者生存时间上应用广泛。然而,单一化疗存在毒副作用大,易诱导肿瘤多药耐药等不足,影响治疗效果。局部给药、纳米载药系统是药物治疗的发展趋势,同时多模式协同抗肿瘤疗法也有利于减轻药物毒性,增强疗效。雷公藤红素(CEL)是中药雷公藤中最主要的抗肿瘤活性单体成分之一。现代药理研究表明,CEL具有广谱、高效的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞具有良好的抑制作用,同时可逆转机体多药耐药。然而其水溶性差,溶出低,生物利用度低及一定肝肾毒性影响了其临床转化。纳米载药系统、局部给药等技术手段,有助于提高雷公藤红素生物利用度,增效减毒。目的本研究拟使用CEL作为模型药物,高分子聚合物聚多巴胺(PDA)作为光热剂,结合纳米技术,设计两类具有光热-化疗协同作用的纳米给药体系,以期克服CEL的不足,弥补单一模式的缺陷,起到增效减毒的作用。方法(1)制备及表征:首先制备了一种无载体纳米给药体系,以泊洛沙姆188为稳定剂,采用沉淀法制备雷公藤红素自组装纳米粒(CEL-NS),通过氧化聚合法表面修饰聚多巴胺(PDA),同时单因素考察了修饰量,得到光热修饰的载药纳米粒子(PDA@CEL-NS)。通过纳米粒径仪、扫描电子显微镜、X-射线衍射仪、红外光谱仪对其粒径大小、形貌特征、晶体特征、红外图谱等进行表征,对其储存稳定性及不同生理介质稳定性进行了考察,进行了体外药物释放实验以及体外光热升温实验评价其释放性能及体外光热升温性能。之后,制备了以金属有机骨架材料(MOFs)为载体的纳米给药体系。首先通过单因素考察及正交实验设计对UIO-66、ZIF-8与MIL-101(Fe)三种MOFs的制备工艺进行优选并比较,从三种常见Th1 immune response纳米MOFs中筛选出最宜的一种作为药物载体,经过吸附法负载CEL,氧化聚合法表面修饰PDA,单因素考察载药工艺及PDA修饰比例,构建载药量高、光热性能好的光热修饰载药MOFs(PDA@MOFs-CEL),对其粒径大小、形貌特征、晶体结构、热重变化、载药量、体外释放及体外光热性能等理化性质进行表征;此外,制备以泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和HPMC为基质的温敏凝胶,纳米粒子分散其中制得金属有机骨架/温敏凝胶复合体系(PDA@MOFs-CEL-GEL),对其胶凝温度、黏度变化及体外溶蚀情况进行考察。(2)体外细胞学评价:以HepG2肝癌细胞为模型,采用CCK-8法评价纳米粒子生物安全性、细胞毒性及光热联合化疗细胞药效,DAPI染色法观察纳米粒子对细胞核形态的影响,细胞划痕损伤修复实验探讨纳米粒子对细胞迁移的影响,流式细胞仪测定纳米粒子对细胞凋亡的影响。(3)体内药效评价:建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,直接观察皮下注射温敏凝胶的滞留情况;通过红外热像仪评价纳米粒子在荷瘤小鼠体内的光热升温效果及瘤内滞留情况;近红外荧光活体成像法监测纳米粒子在荷瘤小鼠体内的生物分布及滞留时间;通过瘤内注射给药,监测瘤体积及瘤重评价光热-化疗协同抗肿瘤药效;取小鼠血清,谷丙/谷草转氨酶检测试剂盒初步评估纳米粒子的肝毒性;药效试验后取小鼠主要脏器进行HE染色,组织病理学评价纳米粒子体内系统毒性。结果(1)体外表征结果表明,制备的PDA@CEL-NS为类球形纳米粒子的水分散溶液,粒径大小189.67±2.08 nm,分布均匀,载药量高达60.33±1.09%。其在考察期间具有较好的稳定性,体外释放表明PDA@CEL-NS可显著增强药物溶出,累计释放率可达60%,体外光热升温研究表明其具有浓度依赖性升温,光热稳定性较好。体外细胞学评价表明,PDA@CEL-NS可浓度依赖性抑制肿瘤细胞增殖,IC50(以CEL计)为2.238 μg/mL,药效强于游离药物(ILBH589临床试验C50值为2.609μg/mL),经808 nm激光处理后,PDA@CEL-NS的肿瘤细胞抑制效果显著增强;DAPI染色实验证实纳米粒子可影响细胞核形态,具有凋亡诱导性,细胞划痕损伤实验表明纳米粒子可抑制细胞迁移,细胞凋亡实验表明诱导细胞凋亡是其细胞毒性机制之一。体内研究证实PDA@CEL-NS在小鼠体内具有较好的光热升温效果,升温效率随着时间推移而降低,表明了纳米粒子被逐步代谢,同时体内药物分布显示纳米粒子肿瘤滞留效果优于原药,药物在体内主要分布于肿瘤组织,在其它主要脏器分布较少,体现了纳米制剂和瘤内给药的优越性。抗肿瘤药效结果表明,PDA@CEL-NPLX3397供应商S外加激光组抑瘤率可达92%,是单独PDA@CEL-NS组的1.57倍,是游离雷公藤红素药物的2.73倍,表现出纳米制剂良好的“增效”作用以及光热-化疗双模式协同抗肿瘤的优越性。最后小鼠血清肝毒性生化指标测定及组织病理学考察,证明了纳米制剂对小鼠主要脏器基本无毒副作用,且相较于原药具有一定肝保护作用。(2)制备了三种常见MOFs纳米载体UIO-66、ZIF-8、MIL-101(Fe),通过粒径大小比较及制备难易比较,筛选出ZIF-8作为纳米载体,制备CEL纳米给药体系,进而PDA表面修饰制备载药量高、光热性能好的PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子。制备的PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子的粒径305.8±8.4 nm,形貌为类球形,形状规则,结晶度好,载药量约为23.47±0.26%。体外释放研究证实其具有良好的缓释效果,且经808 nm激光处理后,体外光热升温性能好,光热稳定性高。制备了以泊洛沙姆和HPMC为基质的温敏凝胶,胶凝温度29℃,将纳米粒子分散于空白凝胶中即可得PDA@ZIF-8-CEL温敏凝胶复合体系(PDA@ZIF-8-CEL-GEL),胶凝温度基本未改变。体外细胞实验评价了PDA@ZIF-8-CEL纳米粒子细胞毒性。实验剂量下,ZIF-8与PDA@ZIF-8具有良好的生物安全性,PDA@ZIF-8-CEL对HepG2细胞半数抑制浓度为2.078 μg/mL,显著优于游离药物,PDA@ZIF-8-CEL加近红外激光处理可进一步增强抗肿瘤效果,体现了良好的光热协同治疗作用。此外,DAPI染色实验、细胞划痕实验及细胞凋亡实验证实PDA@ZIF-8-CEL可通过诱导细胞凋亡诱导细胞核破裂变形及抑制细胞迁移殖。动物体内研究表明,瘤内注射温敏凝胶后,具有良好的瘤内滞留效果,通过直观观察、瘤内光热升温、体内药物分布实验均可得到验证,纳米粒子主要分布于肿瘤组织,在其他主要脏器分布较少,在肿瘤组织滞留时间长,注射后第5天经激光处理,仍可升温至50℃以上。药效试验证实,PDA@ZIF-8-CEL-GEL外加激光组抑瘤作用显著优于其他组,治疗结束后,有两只小鼠肿瘤完全消失,抑瘤率高达97%,显示出温敏凝胶复合体系良好的促进光热-化疗协同作用发挥的功效。取药效试验后小鼠血清,测定肝毒性相关生化指标,结果显示纳米粒子可显著降低血清中谷丙转氨酶含量,表明纳米粒子相较于原药对肝损伤情况有所改善,具有“减毒”作用。组织病理学研究也证实了纳米给药体系对小鼠主要脏器基本无毒副作用。结论本文基于中药活性单体雷公藤红素,结合纳米技术,构建了有无载体两类纳米给药体系,用于光热-化疗双模式协同抗肿瘤。首先构建了聚多巴胺修饰雷公藤红素自组装纳米给药体系,可增强药物溶出,克服了单一模式的不足,体现了光热治疗与化疗双模式抗肿瘤的相辅相成;其次,基于瘤内长效滞留考虑,设计了金属有机骨架/温敏凝胶复合纳米给药体系,将纳米粒子与温敏凝胶有机结合,实现了局部长效滞留,促进了光热-化疗协同作用的发挥,实现了增效减毒的目的。通过纳米技术,将光热治疗、化疗双模式结合抗肿瘤,为肿瘤治疗提供新思路,为雷公藤红素抗肿瘤应用提供一定基础。

糖基转移酶是一类负责生物分子糖基化修饰的酶类。在植物由水生向陆生以及由低等植物向高等植物进化的过程中,糖基转移酶家族的成员数量不断扩张,反映了这类酶在高等植物适应陆地生活环境中的重要性。在植物糖基转移酶超家族中,负责次生代谢小分子物质(包括激素)糖基化的那部分酶,通常是以UDP-糖作为糖供体,所有介导这类修饰反应的酶被称作UDP-糖基转移酶(UGTs)。UGTs能够改变小分子代谢物的结构、生物活性、稳定性等,深刻影响着植物次生代谢物的结构以及功能的复杂性,进而影响植物的生长发育和环境响应。然而,由于UGT家族内成员数量众多,功能复杂多样,目前对这类酶大多数成员的功能尚不清楚。本论文主要针对拟南芥中的两个糖基转移酶基因UGT92Amaterno-fetal medicine1和UGT72D1进行了研究,从多个方面揭示了它们参与植物非生物胁迫的适应性调节,并且发现它们以相反的方式发挥作用。依据相关芯片数据预测,拟南芥的糖基转移酶基因UGT92A1和UGT72D1可能参与植物对盐和渗透胁迫的响应过程。为了研究其逆境响应特性,通过qRT-PCR技术分析了这两个基因在高盐和渗透胁迫下的表达情况。结果发现UGT92A1的表达被诱导上调,而UGT72D1被诱导下调。进一步克隆了UGT92A1和UGT72D1的cDNA并构建了过表达载体,通过遗传转化分别获得了拟南芥的高表达纯合株系;同时,利用CRISPR/Cas9技术也获得了两个突变体纯合株系。利用这些突变体和过表达材料,分获悉更多析了UGT92A1和UGT72D1基因对于植物应对高盐和渗透胁迫的贡献。当对过表达株系和突变获悉更多株系进行盐和甘露醇等逆境胁迫处理时,发现UGT92A1过表达株系在种子萌发、子叶转绿和主根生长等方面表现出比野生型更强的耐逆性表型,而其突变株系则对逆境胁迫处理更加敏感。相比于UGT92A1基因,UGT72D1的转基因株系却表现出相反的表型,表现为其过表达株系对逆境胁迫更加敏感,而其突变株系则耐性更强。进一步地,通过土壤培养体系研究了各转基因株系对胁迫的响应,发现UGT92A1过表达株系的耐旱性和耐盐性比野生型增强,而UGT72D1的过表达株系却对干旱更加敏感。两个基因的突变体都与它们的过表达株系表现出了相反的表型。这些实验结果证明了糖基转移酶基因UGT92A1和UGT72D1在植物应对盐和渗透胁迫的过程中发挥重要作用,但是两个基因的贡献却是相反的。为了探究UGT92A1和UGT72D1参与植物非生物胁迫耐性的生理学基础,测定了UGT92A1和UGT72D1过表达株系和突变株系在盐和甘露醇处理下的一系列生理学指标。通过DAB和NBT细胞学染色实验发现,UGT92A1过表达株系清除活性氧的能力比野生型增强,突变株系清除活性氧能力减弱。与此相反,UGT72D1突变株系增强了活性氧清除能力,而其过表达株系清除活性氧能力较弱。考虑到脯氨酸可以调节植物细胞的渗透平衡,丙二醛会对植物细胞质膜造成损伤,它们的含量水平将在一定程度上反映植物耐受逆境胁迫的能力。因此,分别测定了在盐和甘露醇处理下UGT9A1和UGT72D1过表达株系和突变株系的脯氨酸和丙二醛含量。发现UGT92A1过表达株系中脯氨酸含量较野生型高,丙二醛含量较野生型低;而UGT72D1过表达株系中则是脯氨酸含量较野生型低,丙二醛含量较野生型高。两个基因的突变体都与它们的过表达株系表现出了相反的生理学变化。最后,分别检测了UGT92A1和UGT72D1过表达株系和突变株系在逆境胁迫下DREB2A、RD22、COR47和CAT1等耐逆相关基因的表达变化。发现这些基因在UGT92A1过表达株系中上调倍数比野生型更高,而在UGT72D1过表达株系中上调倍数比野生型更低。在UGT92A1和UGT72D1的突变体中,耐逆相关基因的表达水平与它们的过表达株系都出现了相反的变化。这些实验数据表明,在逆境胁迫下,UGT92A1和UGT72D1转基因株系的生理学变化与上述观察到的耐逆表型变化是一致的。通过以上研究,不仅证明了糖基转移酶基因UGT92A1和UGT72D1参与植物非生物胁迫耐性的功能,并且揭示了这两个糖基转移酶基因以相反的方式发挥作用。论文结果丰富了糖基转移酶基因家族的研究,也为抗逆基因的进一步研究和应用奠定理论基础。但由于时间关系,对这两个基因编码的糖基转移酶UGT92A1和UGT72D1的作用底物和分子机制还缺乏了解,仍需进一步研究。

蜡样芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌,其分布广泛,且具有一定的致病性。不同的蜡样芽孢杆菌携带有不selleck PLX4032同的毒力因子集,这直接决定了蜡样芽孢杆菌致病性的差异。研究和探讨毒力因子分布以及具体毒素的生物活性有助于对蜡样芽孢杆菌病采取更科学的防控。本课题组从猝死牛的脾脏中分离到一株牛源致病性蜡样芽孢杆菌,该菌株的生理、生化、耐药性、致病力和毒力基因分布已在前期工作中进行了初步研究。本研究旨在进一步分析和探讨牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL(由Hbl B、Hbl L1和Hbl L2三亚基组成)的生物学活性。本研究通过生物信息学方法预测了溶血素BL三亚基的理化特性、跨膜结构域和信号肽序列,在原核表达系统中将其重组表达,并对成功表达的蛋白进行了纯化和部分生物学活性的检点击此处测。结果表明,牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL可以在molecular pathobiology原核表达系统中成功表达和纯化,该菌的溶血素BL拥有溶血性、细胞毒性、很好的免疫原性以及对小鼠具有一定的免疫保护性。本研究成功重组表达了溶血素BL三亚基,并探究了溶血素BL的生物学活性。为进一步揭示牛源致病性蜡样芽孢杆菌溶血素BL的作用机制和开发针对牛源致病性蜡样芽孢杆菌病的诊断和防治方法奠定了理论基础。

目的：探讨circRNA＿09505(circ09505)是否通过介导M2型巨噬细胞极化失衡参与强直性脊柱炎（AS）的发病机制。方法：采用高通量ciwaning and boosting of immunityrcRNA测序分析确定AS患者和健康对照者外周血单个核细胞（PBMC）中差异表达的circRNA。将SKG小鼠随机分为对照组、sh-NC组和sh-circ09505组，每组10只。各组小鼠通过腹腔注射3 mg可德胶以建立AS模型。对sh-circ09505组小鼠尾静脉注射circ09505敲减慢病毒，以检查circ09505敲减对AS进展的影响。体外考察circ09505过表达或敲减对巨噬细胞极化影响，并通过流式细胞术分析M1和M2型巨噬细胞比例。结果：circ09505是AS患者PBMC中上调最显著的circRNA。sh-circ09505组小鼠脊柱免疫细胞浸润和软骨破坏较sh-NC组减轻，脊柱炎评分显著降低（P<0.01）。与sh-NC组相比，sh-circ09505组中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著降低（P<0.01），并且脊柱组织中CD11b+CD40+细胞数目显著降低（P<0.01）,CD11b+CD206+细胞数目显著增加（P<0.01）。流式细胞术分析表明，circ09505过表达降低了M2巨噬细胞比例（P<0.01），而circ09MLN8237浓度505敲减则增加了M2巨噬细胞比例（P<0.01）。circ09505过表达增加了LPS+IFN-γ处理组的M1巨噬细胞比例（P<0.01），而circ09505敲减则降低了M1巨噬细胞比例（P<0.01）。结论：circ09505通过促Tofacitinib浓度进M1巨噬细胞极化和抑制M2巨噬细胞极化来加重AS小鼠的脊柱炎症损伤。

黏液层覆盖在黏膜上方，是人体的免疫防线,其在利用静电和疏水作用高效吸附并滞留外来粒子的同时也阻碍了载药纳米粒子的穿透,这给基于纳米载体的跨黏膜疾病的治疗带来困难.本文制备了一种近红外光驱动的具有黏液惰性的纳米马达,用于快速穿透黏液层进行黏膜递送.该纳米更多马达以表面氨基化的介孔二氧化硅纳米粒子作为主体,将两性离子聚合物聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(pCBMA)接枝于其上得到黏液惰性的纳米粒子MSNs-pCBMA;随后,通过将金沉积在MSNs-pCBMA半表面上得到Janus型纳米马达JMSNs-pCBMA,其可以在近红外光的照射下定向运动.透射电子显微镜、傅里叶变换红外光谱、 X射线能谱和热重分析等表征结果表明合成了JMSNs-pCBMA,水合粒径为(329±14) nm, pCBMA的接枝量为0.114 g/g.光热响应实验表明, JMSNs-pCBMA溶液在近红外光照射下具有良好的升温能力.此外,黏液渗透实验表明，p CBMA的接枝和近红外光驱动均提高了纳米粒子在黏液中的渗透能力,其中JMSNs-pExtra-hepatic portal vein obstructionCBMA在近红外光照射4 h后黏液渗透率达到了52.4%,表观渗透系数达到21.9×10-6 cm/s,且在黏液中的运动速度为3.28μ确认细节m/s.体外细胞实验表明, JMSNs-pCBMA具有良好的生物相容性,可在体外被Calu-3细胞高效摄取.本文制备了一种具有快速穿透黏液层能力的纳米马达,为跨黏液层递送载体的构建提供了新思路,将推动纳米马达在黏膜递送中的应用.

地球自转导致24 h周期环境从而产生昼夜节律,几乎所有生物体都具有内源性的计时机制。昼夜节律调控分子机制最重要的发现是转录翻译反馈环(transcriptional translational feedback loop,TTFL)的分子调控Microlagae biorefinery模式。多个生物钟基因参与调节昼夜节律的转录翻译反馈环路。在果蝇中,TTFL中重要的一环是依赖于异二聚体转录因子复合物CLOCK(CLK):CYCLE(CYC)在白天与基因启动子区域特定元件结合,以激活反馈抑制基因period(per)和timeless(timDolutegravir)的转录。积累后,PER和TIM形成异二聚体,从细胞质转移到细胞核以抑制CLK:CYC介导的夜间转录活性。尽管某些生物钟分子因物种而异此网站,但这种基于转录翻译的负反馈回路的基本框架在几乎所有生物中都是保守的。在哺乳动物中,CLK:BMAL1异二聚体激活反馈抑制因子Per1/Per2和Cry1/Cry2。积累后,PER和CRY易位至细胞核以抑制CLK:BMAL1活性。但是,PER和CRY2对CLK:BMAL1的转录激活能力抑制的一些细节尚未完全了解,比如PER和CRY2是一定要形成复合物还是可以单独行使抑制功能?二者在昼夜节律调控中是否存在差异?鳞翅目昆虫的内在时钟分子机制与果蝇有所差异,其生物钟机制介于典型的果蝇和哺乳动物之间。本研究聚焦鳞翅目昆虫小菜蛾昼夜节律的分子机制,建立了小菜蛾昼夜活动节律监测系统,利用CRISPR/Cas9技术对生物钟基因Pxper和Pxcry2进行单基因和双基因敲除,利用体外体内基因功能研究和时间序列转录组测序分析等手段,重点阐明小菜蛾生物钟基因Pxper和Pxcry2介导的昼夜节律调控差异。主要研究内容和结果如下:(1)参考果蝇昼夜活动监测系统,建立小菜蛾昼夜活动节律行为监测体系。光照黑暗循环(LD)条件下,雄虫和雌虫都表现出夜间活动模式,活动在熄灯后1h内达到顶峰,在开灯后迅速下降。在26℃条件下,小菜蛾雌虫和雄虫在完全黑暗(DD)条件下的自由活动节律监测比较困难。在20℃条件下,雄虫更适合用于研究小菜蛾自由活动的昼夜节律。(2)分析比对小菜蛾基因组数据库,克隆小菜蛾关键生物钟基因Pxper和Pxcry2,并对其表达和体内外功能进行分析。发现小菜蛾存在1个PER样基因(Pxper)和3个CRY样基因(Pxcry1、Pxcry2和6-4 photolyase)。克隆测序确定了小菜蛾的Pxper和Pxcry样基因的准确序列信息,发现Pxper和Pxcry2基因在小菜蛾头部表达均存在明显节律变化,但节律表达的模式并不一致。Px CRY2而非Px PER或其他CRY样蛋白表现出对CLK:BMAL1转录激活能力的强抑制。小菜蛾Px PER的功能可能是物种特异性的,并不完全类似果蝇Dm PER的功能。Pxcry1而非Pxcry2或6-4 photolyase的表达恢复了果蝇Dmcry~b突变体对光刺激的反应。(3)构建小菜蛾Pxper和Pxcry2单基因突变体,Pxper和Pxcry2双基因突变体,对突变体的昼夜节律行为进行分析。确认果蝇“无节律”突变体Dmper~(01)的Q464残基在小菜蛾Px PER中的Q382位置是保守的。构建了小菜蛾Pxper基因突变体(Pxper-KO),对应Q382附近的1个碱基对缺失导致翻译提前终止。构建了靶向Pxcry2基因1号外显子区域的突变体(Pxcry2-KO),其为2个碱基对缺失导致缺失处附近翻译提前终止。通过杂交和分子鉴定筛选的方式成功制备Pxper和Pxcry2双突变体Pxper Pxcry2-d KO。昼夜活动节律和羽化节律分析表明,Pxper和Pxcry2突变均导致LD条件下关灯后的活动高峰消失,Pxcry2缺失还导致整体活动量下降和活动节律消失。Pxcry2在DD条件下维持小菜蛾的内源活动和羽化节律至关重要。(4)利用转录组测序分析生物钟基因Pxper和Pxcry2在小菜蛾头部介导的基因表达节律调控差异。LD条件下:对照组小菜蛾头部有1098个节律表达基因,其中大部分基因的节律变化依赖Pxper和Pxcry2的正常功能。Pxper-KO明显影响节律基因表达的相位,而Pxcry2-KO不影响。转录组检测的对照组小菜蛾Pxper和Pxcry2表达节律与q PCR检测的结果一致,Pxcry2的表达相位相比Pxper发生了接近4 h的推迟。不同核心生物钟基因的表达节律或表达水平在Pxper-KO或Pxcry2-KO表现多样,只有部分基因的表达符合PER:CRY2复合体抑制CLK:BMAL1的转录激活能力的模型预测,提示Px PER和Px CRY2对其它核心生物钟基因的调控存在显著差异。大部分核心生物钟基因在Pxper和Pxcry2相关突变体中的表达节律均消失,而Pxcry2在这些突变体中均能维持节律表达,但是节律表达振幅(r AMP)非常明显下降,并且表达相位也发生改变。小菜蛾大脑中的节律基因涉及光转导信号、核苷酸切除、脂肪酸延长和剪接体等多种生物过程,这些生物过程的节律变化同时依赖Pxper或Pxcry2的正常功能。DD条件下:对照组小菜蛾头部的节律表达基因与其在LD条件下的节律表达基因重叠非常低,仅为78个。随着进入DD时间的延长,小菜蛾头部核心生物钟基因的表达节律会非常明显地减弱或消失。综上所述,本课题建立了小菜蛾昼夜活动节律行为监测体系,鉴定表征了小菜蛾关键生物钟基因Pxper和Pxcry2并构建了突变体,昼夜节律行为和转录组分析揭示了小菜蛾Px PER和Px CRY2参与生物钟基因转录翻译反馈环路的可能调控机制。小菜蛾生物钟基因Pxper和Pxcry2介导的昼夜节律行为和分子调控存在差异,并不只是简单的原先假设的PER:CRY2形成复合物一起抑制CLK:BMAL1的转录激活能力,存在更复杂的调控机制。本研究也为夜行性动物生物钟转录翻译反馈调控机制提供一个新的参考模型。

目的：比较辨证针刺与艾司唑仑治疗慢性失眠的临床疗效及对认知功能的影响。方法：将90例慢selleck Bemcentinib性失眠患者随机分为针刺组和药物组，各45例。针刺组采用辨证针刺治疗，穴取四神聪及双侧神门、三阴交，并结合辨证配穴，每日治疗1次，连续治疗6 d后休息1 d，共治疗4周；药物组采用睡前口服艾司唑仑片治疗，每次1片，共治疗4周。比较两组患者治疗前后匹兹堡睡眠质量指数（PSQI）、简易精神状态BIBW2992体内实验剂量检查量表（MMSE）、蒙特利尔认知评估量表（MoCA）及听觉词语记忆测验（AVMT）评分，并评定临床疗效。结果：治疗后，两组患者PSQI各项评分及总分均较治疗前降低（P<0.05），且针刺组低于药物组（P<0.05）；两组患者MMSE、MoCA评分及AVMT各项评分均较治疗前升高（P<0.0Medial pivot5），且针刺组高于药物组（P<0.05）。针刺组总有效率为80.0%(36/45)，高于药物组的53.3%(24/45,P<0.05)。结论：辨证针刺可改善慢性失眠患者的睡眠质量和认知功能，疗效优于艾司唑仑。