achr抑制剂

研究背景及目的:天然免疫系统介导的抗病毒免疫应答是机体抵御病毒感染的第一道防线。病毒的核酸成分可作为病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),被固有免疫细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别,进而启动抗病毒天然免疫应答。细胞内多种PRRs识别病毒核酸成分后,招募相应的接头蛋白,激活一系列信号转导通路,最终启动Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)及干扰素诱导基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达,产生抗病毒效应。病毒感染可破坏宿主细胞内的胆固醇稳态。病毒入侵、脱衣壳、复制、子代病毒组装及释放的过程都需要胆固醇的参与。不仅如此,宿主的胆固醇代谢也是机体抗病毒天然免疫应答的关键调控因素。研究证实,抑制胆固醇合成通路可显著上调IFN-Ⅰ及ISGs的表达,进而抑制病毒感染。因此,调控宿主细胞内的胆固醇稳态,降低胆固醇对病毒的可用性,可在一定程度上抑制病毒的感染,靶向调控宿主的胆固醇稳态已经成为抗病毒治疗的新策略。T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4,Tim-4)主要表达在抗原提呈细胞表面,在维CL 318952持巨噬细胞稳态和功能方面发挥重要作用。作为磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PtdSer)受体,Tim-4不仅可以促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,还能够促进有包膜病毒的入侵过程。然而,Tim-4在抗病毒天然免疫应答中的作用尚不清楚。本文主要探究Tim-4在巨噬细胞抗病毒天然免疫应答中的具体作用,旨在揭示巨噬细胞内胆固醇稳态的调控机制,阐明Tim-4新型生物学功能,并为抗病毒干预策略提供新的候选靶点。研究方法及结果:1.Tim-4抑制巨噬细胞Ⅰ型干扰素应答、促进病毒的复制为探究Tim-4是否参与调控巨噬细胞抗病毒天然免疫应答,首先使用水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)和仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染巨噬细胞,通过western blotting、流式细胞术及qRT-PCR检测,发现病毒感染可上调巨噬细胞中Tim-4的表达。随后,使用VSV、SeV感染,或Poly(I:C)、Poly(dA:dT)刺激野生型(Wild type,WT)和Tim-4敲除(Tim-4 knockout,Tim-4 KO)小鼠的原代腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PEMs),qRT-PCR、ELISA、流式细胞术及 western blotting结果表明,Tim-4缺失显著促进RNA病毒或类似物及DNA类似物诱导的Ⅰ型干扰素通路的活化,同时显著抑制病毒的复制。VSV体内感染实验证实,Tim-4KO小鼠血清及组织中IFN-β的含量显著升高,VSV复制水平降低,肺组织损伤减轻。为排除Tim-4在体内对其他免疫细胞的影响,我们进行了巨噬细胞过继回输实验。受体鼠清除巨噬细胞后尾静脉回输WT或Tim-4 KO PEMs,随后进行VSV感染。结果表明,Tim-4 KO PEMs回输组小鼠血清及组织中IFN-β表达显著上调,VSV病毒载量下降。上述结果表明Tim-4可抑制巨噬细胞中RLR或cGAS诱导的Ⅰ型干扰素通路,促进病毒的复制。2.Tim-4通过增强SREBP2活化促进胆固醇合成抑制巨噬细胞Ⅰ型干扰素应答为明确Tim-4调控巨噬细胞抗病毒天然免疫应答的具体机制,利用WT和Tim-4 KO小鼠PEMs进行转录组测序。基因富集分析结果显示,与Tim-4KO组相比,WT组PEMs中胆固醇稳态相关基因显著富集,提示Tim-4可能与巨噬细胞内胆固醇的稳态相关。Filipin染色及Amplex red胆固醇定量检测结果表明,Tim-4缺失显著下调巨噬细胞内胆固醇的含量。固醇调节元件结合蛋白 2(Sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)是胆固醇生物合成过程中的总调节因子。通过western blotting及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色,发现Tim-4能够促进SREBP2的活化及细胞核定位。qRT-PCR结果证明,Tim-4可上调SREBP2下游多种酶的表达。此外,VSV感染后,Tim-4促进巨噬细胞内胆固醇积累及SREBP2活化的作用更加明显Oxidative stress biomarker。使用SREBPs活化抑制剂Fatostatin体外刺激巨噬细胞并进行VSV感染,qRT-PCR、ELISA及western blotting结果显示,Tim-4抑制巨噬细胞中IFN-β产生及IRF3磷酸化的作用消失。WT和Tim-4 KO小鼠腹腔注射Fatostatin后进行VSV感染,结果表明,两组小鼠血清、组织中IFN-β含量、病毒复制水平及病毒载量间无明显差异。另外,干扰Srebf2或补充外源性胆固醇可逆转Tim-4缺失对Ⅰ型干扰素应答和VSV复制的调控作用https://www.selleck.cn/products/wnt-c59-c59.html。上述结果表明,Tim-4通过促进SREBP2的活化及胆固醇生物合成抑制巨噬细胞中I型干扰素通路的活化,进而促进病毒的复制。3.Tim-4抑制Insig1与SCAP结合促进巨噬细胞SREBP2活化及胆固醇合成文献显示,未成熟的SREBP2与SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)组成复合体。当细胞内胆固醇含量较高时,胰岛素诱导基因(Insulin-induced gene,Insigs)结合 SCAP,将 SCAP-SREBP2 复合体滞留于内质网中;当细胞内胆固醇含量较低时,SCAP-SREBP2复合物与Insigs解离,通过COPII囊泡转位至高尔基体。高尔基体中两种金属蛋白酶S1P和S2P依次切割SREBP2,产生NH2末端即活化形式的SREBP2,入核发挥转录调节作用。为明确Tim-4调控SREBP2活化的分子机制,细胞分别转染全长或成熟形式的SREBP2质粒,western blotting检测其活化情况。结果表明,Tim-4可促进全长形式SREBP2的活化,但是对成熟形式SREBP2的水平没有影响,提示Tim-4可能参与SREBP2从内质网到高尔基体的转位过程。进一步通过IF、分离内质网和高尔基体组分,发现Tim-4确实能够促进SREBP2从内质网到高尔基体的转位过程。免疫共沉淀和IF实验进一步证实,Tim-4能够分别与Insig1及SCAP相互作用,抑制Insig1和SCAP间的结合,从而促进SCAP-SREBP2复合体从内质网到高尔基体的转位及后续的活化过程。利用Tim-4不同区域缺失的突变体进行免疫共沉淀及功能验证,发现Tim-4可能通过其胞内段结合Insig1和SCAP,当胞内段缺失后,Tim-4则不能调控巨噬细胞中SREBP2的活化和抗病毒天然免疫应答。综上,Tim-4通过抑制巨噬细胞内Insig1-SCAP的结合促进SREBP2的活化,从而负调控抗病毒天然免疫应答。研究结论及意义:本研究阐明了 Tim-4在调控Ⅰ型干扰素通路中的作用及机制。发现Tim-4通过结合Insig1及SCAP,抑制Insig1和SCAP间的相互作用,促进巨噬细胞内SREBP2的活化及胆固醇从头合成,从而抑制抗病毒天然免疫应答。本研究结果揭示了巨噬细胞胆固醇稳态调控的新机制,为抗病毒药物的研发提供了新靶点,为Tim-4调节胆固醇稳态参与巨噬细胞功能重塑提供了新思路。

腈水解酶(Nitrilase,NIT)在植物界中广泛存在,可以催化腈化物生成氨与相应的羧酸。拟南芥中有四个腈水解酶编码基因,分别是NIT1,NIT2,NIT3与NIT4。NIT4主要参与氰化物解毒,NIT1,NIT2与NIT3有较高的氨基酸同源性,能够以较广泛的腈化物作为底物。可以催化吲哚-3乙腈(Indole-3-acetonitrile,IAN)形成吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)。IAA是植物中最重要的生长素,与其他激素或拮抗或协同形成了复杂的信号网络共同调控植物的免疫防御反应。根据前人报道,对不同的病原菌NIT1/2/3起到的作用并不相同。NIT1和NIT2负向调控拟南芥对芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)的抗性。NIT1,NIT2和NIT3正向调控拟南芥对卵菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)与丁香假单胞菌Pst DC3000(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性。到目前为止,NIT1/2/3的抗病分子机制尚不明确。本研究以NIT1/2/3的单缺失突变体和三缺失突变体为材料,通过转录组测序分析,初步探究NIT1/2/3对病原菌信号的响应及抗病机制。为了探究细菌病原体信号flg22和病原体Pst DC3000对NIT1/2/3的表达及其介medical malpractice导的生长素的影响,本实验对实验室前期构建的转基因植株Pro NIT1::GUS,Pro NIT2::GUS,Pro NIT3::GUS,Pro DR5::GUS WT,Pro DR5::GUS nit1,Pro DR5::GUS nit2和Pro DR5::GUS nit3进行了分析。发现在幼苗期,fselleckchemlg22与Pst DC3000对NIT1/2/3的表达及其介导的生长素的含量与分布均无显著影响。但在成熟期,NIT1/2/3的表达及其介导的生长素的含量与分布均对Pst DC3000有显著的响应。Pst DC3000诱导了NIT1/2/3的表达,Pst DC3000处理后,GUS染色结果显示WT中的生长素含量显著升高,缺失突变体中的生长素含量也提高,但幅度较小,同时生长素的分布发生了变化。因此本实验推测NIT1/2/3的抗病性可能与发育阶段密切相关。为确定NIT1/2/3对Pst DC3000抗病性的影响,本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以nit2突变体为基础,敲除NIT1和NIT3获得了nit1nit2nit3三缺失突变体。对WT,nit1,nit2,nit3与nit1nit2nit3的幼苗与成苗进行Pst DC3000侵染,通过表型观察、菌定量检测以及细胞死亡检测对抗病性进行分析。结果表明,在幼苗时,野生型与缺失突变体对Pst DC3000的抗性没有明显差异。但在成熟期时,缺失突变体相比于野生型对Pst DC3000更加敏感。这说明NIT1/2/3对抗病性的影响与发育阶段密切相关,在幼苗期NIT1/2/3对抗病性没有影响,但在成熟期NIT1/2/3在抵御Pst DC3000的过程中具有正向调控作用。为进一步明确NIT1/2/3的抗病机制,以WT和nit1nit2nit3为对照组,Pst DC3000处理后的WT和nit1nit2nit3为实验组进行转录组测序及数据分析。结果发现nit1nit2nit3在Pst DC3000处理后水杨酸途径与部分正向调控抗病的基因表达上调,这与nit1nit2nit3对Pst DC3000敏感的表型是相互矛盾的。由于NIT1/2/3催化IAN形成IAA,因此nit1nit2nit3呈现生长素缺失的表型。理论上讲,对于半活体寄生菌Pst DC3000生长素的缺失有利于抗病信号的转导,转录组的数据也证明了这一点,nit1nit2nit3的抗病性应该是增强的。但事实上,nit1nit2nit3的抗病性减弱。因此,本实验推测NIT1/2/3在抗病防御中可能有双重功能。nit1nit2nit3中一方面由于生长素的缺失,激活了部分抗病信号,另一方面可能有某种抗病途径发生了缺失,两者综合导致了抗病性减弱。鉴于NIT1/2/3的活性是催化腈类物质的降解,因此腈类物质的代谢与NIT1/2/3的功能密切相关。次生代谢产物芥子油苷降解后可形成多种产物,腈是其中一种。吲哚族芥子油苷和芳香族芥子油苷降解后形成的腈被NIT1/2/3降解后形成IAA和PAA,两者均为生长素,因而NIT1/2/3的功能总是与生长素联系在一起。但脂肪族芥子油苷降解后形成的腈类物质,是否会被NIT1/2/3降解,及降解产物的生物学功能目前尚无报道。根据研究结果,本实验推测NIT1/2/3对病原菌的正向调控作用可能与脂肪族芥子油苷有关。因此对WT和nit1nit2nit3在进行Pst DC3000侵染时同时外源施加了脂肪族芥子油苷4MSB(4-methylsulfinyl-n-butyl glucosinolate)并观察抗病性的变化。结果表明,WT在Pst DC3000侵染的同时施加4MSB,其抗病性提高。但在nit1nit2nit3侵染selleck产品Pst DC3000时同时施加4MSB,其抗病性无变化。表明4MSB提高抗病性依赖于NIT1/2/3,从一定程度上验证了本实验的假设。综上所述,NIT1/2/3在抗病防御反应中可能有双重功能,nit1nit2nit3可能一方面通过生长素缺失对抗病性产生了积极作用(如促进某些抗病基因的表达),另一方面可能由于脂肪族芥子油苷的腈类水解产物无法被NIT1/2/3进一步降解,而丧失了抗病能力。本实验的研究揭示了NIT1/2/3功能的多样性及作用机制的复杂性,为深入探究NIT1/2/3与植物抗病性的关系奠定了基础,也为深入理解拟南芥的抗病调控机制提供了有益的数据参考。

I黄酮类化合物对有机阴离子转运体3的调控及分子机制研究有机阴离子转运体3(organic anion transporter 3,OAT3)是由溶质载体家族22A8(SLC 22A8)基因编码的摄取型转运体,主要表达在肾小管基底外侧膜上,介导体内许多内源性物质及外源性药物摄取进入肾脏,在其底物的肾排泄过程中发挥重要作用。有研究发现,抑制OAT3可减少肾毒性的底物药物进入肾脏,从而缓解药物引起的急性肾损伤(AKI)。因此,寻找高效低毒的OAT3抑制剂对缓解临床上OAT3介导的AKI具有重要意义。黄酮类化合物是我们日常饮食中常见的膳食多酚类LEE011化合物,具有众多药理活性且安全性好。但近年来有研究发现有些黄酮可以通过抑制转运体功能引起药物-药物相互作用(Drug-drug interactions,DDIs)。本研究应用人源化高表达的OAT3-HEK293细胞模型,研究了水果、蔬菜及中草药中富含的97种黄酮类化合物对OAT3转运活性的影响,筛选出对OAT3具有较强抑制作用的黄酮。在细胞和整体动物模型中进一步评价黄酮对OAT3抑制的生物学效应,考察对呋塞米的药代动力学影响及对甲氨蝶呤诱导的大鼠肾损伤的改善。然后构建药效团模型,阐明黄酮类化合物与OAT3的构效关系,为黄酮化合物的结构优化以及预测临床潜在的食物/中草药-药物相互作用提供实验依据。实验结果摘要如下:1.黄酮类化合物对OAT3的抑制作用以及生物学效应评价1.1 OAT3-HEK293细胞摄取实验初筛结果表明,97种黄酮中有17种对OAT3具有较强的抑制作用(抑制率>50%),包括毛蕊异黄酮、染料木素、香叶木素、柚皮苷、山奈酚、艾黄素、木犀草素、高车前素、草质素、鹰嘴豆芽素A、异橙黄酮、甜橙黄酮、千层纸素A、α-萘黄酮、β-萘黄酮、7-羟基黄酮和松属素;49种黄酮对OAT3的抑制作用较弱(抑制率20%-50%);其余31种黄酮对OAT3的转运活性无显著影响(抑制率<20%)。1.2在OAT3-HEK293细胞中,对抑制率大于50%的黄酮进行了抑制强度IC50的测定,结果表明异橙黄酮(IC50=9.60 μM)对OAT3的抑制作用最强,其次是高车前素(IC50=12.21 μM)、香叶木素(IC50=18.59μM)、α-萘黄酮(IC50=26.02 μM)、7-羟基黄酮(IC50=38.71 μM)、艾黄素(IC50=40.83 μM)、木犀草素(IC50=42.35 μM)、柚皮苷(IC50=42.35 μM)、松属素(IC50=43.37μM)、毛蕊异黄酮(IC50=46.92 μM)、千层质素A(IC50=62.17 μM)、甜橙黄酮(IC50=70.02 μM)、β-萘黄酮(IC50=81.02 μM)、草质素(IC50=84.62μM)、山奈酚(IC50=88.77 μM)、染料木素(IC50=90.97 μM)和鹰嘴豆芽素A(IC50=93.75 μM)。1.3在马兜铃酸I(AA-I)诱导的OAT3-HEK293细胞损伤模型中,阳性抑制剂丙磺舒和5种较强的黄酮抑制剂异橙黄酮、高车前素、香叶木素、α-萘黄酮和7-羟基黄酮均能使AA-I的细胞毒性减小,细胞存活率上升,其中,7-羟基黄酮的作用最为明显,使AA-I在10-100μM浓度范围内的细胞存活率曲线显著上移。上述结果提示,黄酮抑制剂可通过抑制OAT3转运活性降低AA-I的摄取,从而降低其细胞毒性。1.4在SD大鼠体内,黄酮化合物对OAT3抑制作用的生物学评价结果表明,大鼠提前30min 口服上述5种黄酮抑制剂后,与对照组相比呋塞米的AUC0-t增加11.54%-59.08%,但弱于阳性抑制剂丙磺舒(310.48%)。上述结果提示,黄酮抑制剂在SD大鼠体内对OAT3的调控可影响到底物药呋塞米的体内暴露量。1.5在甲氨蝶呤(MTX)诱导的SD大鼠肾损伤模型中,阳性抑制剂丙磺舒和上述5种黄酮抑制剂均能不同程度的降低大鼠血清BUN和CREA水平,且使肾内甲氨蝶呤浓度与单独给药组相比减少22.68%-44.33%。上述结果提示,黄酮抑制剂可能通过抑制OAT3介导的摄取作用减少甲氨蝶呤进入肾脏,从而发挥肾保护作用。2.黄酮类化合物与OAT3的构效关系研究黄酮类化合物对OAT3产生抑制作用的构效关系研究结果表明,黄酮类化合物4、7位的氢键受体和4'位的疏水基团是黄酮对OAT3产生抑制作用的关键药效团,当这些位置与空间位阻较大的基团结合时,黄酮对OAT3的抑制作用减小甚至消失,上述结果可为黄酮类化合物的结构改造提供实验依据。综上所述,本研究应用人源化高表达的OAT3-HEK293细胞模型对97种黄酮类化合物进行初步筛选,并对体内外抑制作用的生物学效应进行评价,5种较强黄酮抑制剂可通过抑制OAT3转运活性降低AA-I的细胞毒性、改变呋塞米的药代动力学特征和减轻甲氨蝶呤造成的急性肾损伤。药效团模型的构建可初步阐明黄酮类化合物和OAT3之间的构效关系,为指导黄酮类化合物的结构优化,开发高效低毒的OAT3抑制剂来减轻AKI提供有价值的参考依据。Ⅱ生物碱类化合物对葡萄糖转运体1的调控及分子机制研究葡萄糖转运体1(glucose transporter 1PD-0332991,GLUT1)是由溶质载体家族2A1(SLC 2A1)基因编码的膜蛋白,与细胞的糖摄取和能量代谢密切相关。GLUT1在人体绝大多数的组织细胞中均有分布,通常以较低水平表达。但是,在肺癌、乳腺癌、肝癌等多种高发病率的癌细胞中GLUT1会异常高表达,为癌细胞的增殖迁移提供充足能量。研究发现,抑制GLUT1不仅可以通过减少糖摄取靶向抑制肿瘤生长,还可增加抗癌药物的敏感性,改善肿瘤耐药性问题。因此,目前GLUT1抑制剂的研究已成为全球研发热点。天然产物一直是抗癌药物开发的重要来源,已报道姜黄素、槲皮素、棉酚等天然产物的抗肿瘤活性可能与抑制GLUT1介导的葡萄糖摄取过程有关。生物碱类化合物是一大类主要存在于植物中的含氮天然产物,且具有突出的抗癌活性,紫杉醇、高三尖杉酯碱等生物碱已广泛应用于多种癌症的临床治疗。因此,在生物碱中寻找GLUT1抑制剂可为研发高效的多靶点抗癌药物提供新思路。本研究利用高表达人源化GLUT1的HEK293t细胞模型,研究植物中常见的130种生物碱对GLUT1功能的调控作用,从中筛选出对GLUT1具有较强抑制活性的生物碱,在人肝癌(HepG2)细胞中进一步考察生物碱对GLUT1抑制的生物学效应。然后,应用CDOCKER分子对接技术探究生物碱类化合物抑制GLUT1的分子机制。构建药效团模型阐明二者之间的构效关系,为预测未经检测的生物碱类化合物对GLUT1的活性影响,及GLUT1抑制剂的结构优化和改造提供实验依据。实验结果摘要如下:1.生物碱类化合物对GLUT1转运功能的影响以及生物学效应评价1.1 GLUT1-HEK293t细胞摄取实验初筛结果表明,千金藤素、二氢小檗碱、酒石酸长春质碱、盐酸小檗胺和延胡索甲素这5种生物碱对GLUT1有较强的抑制作用(抑制率>50%)。另有46种生物碱对GLUT1的抑制作用较弱(抑制率为20%-50%),其余79种生物碱在100μM或最大无毒浓度下对GLUT1无明显抑制作用(抑制率<20%)。1.2在GLUT1-HEK293t细胞中,对抑制率大于50%的生物碱进行了抑制强度IC50的测定,结果表明,二氢小檗碱对GLUT1转运2-NBDG的抑制作用最强(IC50=39.78 μM),其次为盐酸小檗胺(IC50=44.06μM),延胡索甲素(IC50=50.68 μM),酒石酸长春质碱(IC50=59.1 μM),千金藤素(IC50=67.28 μM)。1.3在人肝癌(HepG2)细胞中评价生物碱对GLUT1抑制活性的生物学效应,结果显示,二氢小檗碱、延胡索甲素和酒石酸长春质碱均可使索拉非尼的细胞毒性显著增加,其中,二氢小檗碱的作用最强,使索拉非尼在HepG2细胞中的IC50值从14.38 μM下降至5.43 μM,显著低于阳性抑制剂槲皮素的IC50值10.87 μM。上述结果提示,GLUT1的生物碱抑制剂可增强HepG2细胞对索拉非尼的敏感性,发挥抗肿瘤协同作用,且优于阳性抑制剂槲皮素。2.生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的分子机制以及构效关系研究2.1生物碱与人GLUT1蛋白的分子对接结果表明,GLUT1蛋白内腔中的Gln283、Asn288、Asn317、Asn411、Trp412和Ile164氨基酸残基可能是发生抑制作用的关键位点。此外,氢键和Pi-烷基键的形成可能是生物碱类化合物对GLUT1抑制作用的关键因素,且形成数量与抑制强度呈正相关。2.2生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的构效关系研究结果表明,氢键受体和疏水基团是生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的重要药效团。结合体外研究结果发现,生物碱中的疏水作用的基团在抑制活性中发挥关键作用,如烃基、甲氧基、酯基、酰胺基等。综上所述,本研究应用人源化高表达的GLUT1-HEK293t细胞模型系统地malaria vaccine immunity研究了中草药中常见的130种生物碱类化合物对GLUT1转运活性的影响。筛选出对GLUT1具有较强抑制作用的5种生物碱,在HepG2细胞中进一步证实抑制GLUT1可增强癌细胞对索拉非尼的敏感性。分子对接结果表明,氢键和Pi-烷基键的形成是生物碱类化合物对GLUT1产生抑制作用的关键因素。药效团模型结果提示疏水基团在生物碱抑制GLUT1功能中发挥关键作用。上述结果为指导生物碱化合物的结构改造,开发高效低毒的GLUT1抑制剂改善肿瘤治疗提供有价值的参考依据。

为阐明珠江三角洲地区黄毛鼠Rattus losea对第1代抗凝血灭鼠剂的抗性发生趋势及其遗传机制，以杀鼠灵为标准药物，采用致死期食毒法对2017—2021年在广东省江门市捕获的165只黄毛鼠进行生理抗性prescription medication检测，并测定每只试鼠的维生素K环氧化物还原酶复合物亚单位1(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1,Vkorc1)的编码基因序列，分析其突变情况。结果显示，江门市黄毛鼠对第1代抗凝血灭鼠剂杀鼠灵的抗性率为27.0DS-3201作用3%～50.00%，在黄毛鼠Vkorc1基因中检测到6个不同的突变位点，包括2个错义突变位点Arg58Gly及Tyr139Cys和4个沉默突变位点Ala41Ala、Cys96Cys、Arg98Arg及Ala143Ala，突变率分别为87.27%、0.61%、1.21%、0.61%、1.21%和0.61%，其中Ala143Ala是在黄毛鼠中新发现的沉默突变位点。表明珠江三角洲地区黄毛鼠已对第1代抗凝血灭鼠寻找更多剂产生了群体抗性并呈上升趋势，第58位的精氨酸突变成甘氨酸(Arg58Gly)是黄毛鼠抗性基因Vkorc1的主要突变位点。

背景精神疾病分为器质性和功能性两大类。感染和免疫反应是导致精神症状的重要原因。无论是器质性精神障碍还是功能性精神疾病都有可能存在不同程度的免疫反应损伤。有关免疫反应的神经抗体检测有助于早期诊断和评估治疗预后。然而基于细胞底物的实验(cell-based assay,CBA)是针对已知抗体的特异性抗体检测,不能识别未知抗体;而基于组织底物的实验(tissue-baseLaduviglusibd assay,TBA)可以是一个有效的补充手段,也是发现未知抗体的途径之一。TBA在大样本中评估器质性精神障碍和功能性精神疾病中的诊断及预后待进一步研究。目的本研究Ceralasertib体内拟探究在本中心就诊的可能的自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis,AE)患者中,CBA阴性但TBA阳性的比例及亚细胞定位情况,并分析本中心单独通过TBA法诊断AE的敏感性和特异性;分析TBA在神经梅毒和功能性精神疾病的诊断和预后评估中的意义。方法本研究纳入了从2018-01-01至2021-12-31就诊于本中心神经内科或精神科的神经精神疾病患者,如以精神症状为主要表现的自身免疫性脑炎和神经梅毒患者,以及功能性精神疾病如分裂症、情感障碍等。对其一般人口学特征、实验室检查结果、脑脊液检查结果、影像学检查结果、治疗预后等进行统计分析,并对所有入组患者进行脑脊液TBA和自身免疫性脑炎抗体谱的检测,分析CBA阴性TBA阳性的神经靶抗原的亚细胞定位;通过曲线下面积计算TBA对AE诊断的敏感性和特异性;分析TBA阳性与TBA阴性患者在神经梅毒和功能性精神疾病临床特点和治疗预后上的差异。结果纳入212名符合可能AE的患者,男性116例,平均年龄为35.77±16.8岁,其中,根据CBA检测阳性结果确诊的AE有61例(29%,61/212)。TBA在已知抗体阴性的可能AE的诊疗中具有重要意义:在其余151例CBA阴性的可能AE患者中TBA阳性的有67例(44.37%,67/151),根据染色的细胞形态,分为神经元细胞染色48例(其中细胞膜8例,细胞核19例,细胞浆21例),胶质细胞染色15例,神经元细胞和胶质细胞同时染色4例。对TBA阳性染色在神经元的细胞膜的8例患者,进行回顾性分析,只有3例进行了免疫治疗,预后良好;另外5例未经过免疫治疗,有3例预后不良,存在不同程度的认知障碍和社会功能下降。说明仅根据CBA进行AE的确诊可能存在漏诊,或者有存在未知抗体的可能性。另外我们还单独通过TBA法在纳入的212例可能的AE患者中分析TBA对AE的诊断价值,证明TBA阳性是确诊AE的预测因素,灵敏度和特异度分别为78.7%和55.6%,若TBA阳性联合脑脊液白细胞计数升高,则灵敏度和特异性分别为57.4%,79.5%。纳入81例诊断为神经梅毒的患者中,男性62例,中位年龄54岁(47.75-60岁)。经CBA检测,4例患者分别有抗NMDAR、AQP4和GAD65抗体。TBA试验免疫染色阳性38例(38/81,46.9%),其中神经元染色21例(21/38,55.3%),胶质细胞染色11例(11/38,28.9%),神经元和胶质细胞共染色6例(6/38,Biotin cadaverine15.8%)。我们比较了TBA阳性和阴性患者的临床特征和治疗结果,发现TBA阳性染色与梅毒抗体滴度和头部MRI异常显著相关。TBA阳性神经梅毒患者的认知预后明显差于TBA阴性患者。纳入33例功能性精神疾病患者包括11例精神分裂症、5例急性而短暂的精神病性障碍和17例情感障碍(抑郁发作11例,躁狂发作4例,混合发作2例)。通过进行临床资料分析,我们发现33例精神疾病患者中有17例(51.5%,17/33)呈TBA阳性结果;TBA阳性与MR发现脑白质少量脱髓鞘病灶显著相关,与甲状腺抗体水平升高有相关趋势,无统计学意义(P=0.085),与脑脊液生化有相关趋势,无统计学意义(P=0.085);随访2年结果显示TBA结果与社会功能下降也有相关趋势(P=0.101)。CBA阴性但TBA阳性的结果提示功能性精神异常患者有可能存在未知的抗神经元抗体,值得进一步大样本量进行后续研究。结论仅根据CBA进行AE的确诊可能存在漏诊,TBA在已知抗体阴性的可能AE的诊疗中具有重要意义;TBA结果结合临床症状和脑脊液细胞数,可以提高自身免疫性脑炎患者的诊断率;TBA方法提示了疾病可能的免疫介导损伤的信息,可以是神经梅毒及功能性精神疾病患者临床症状和治疗预后的评估指标之一。

目的 通过对2022年收集的海南省136株耐药结核分枝杆菌进行基因分型研究，了解和掌握海南省不同耐药结核分枝杆菌基因型的流行情况及耐药率，为海南省结核病防治策略提供科学依据。方法 收集海南省结核分枝杆菌耐药菌株136株，采用间隔区寡核苷酸分型技术（Spoligotyping）对结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型，并对不同基因型结核分枝杆菌的耐药率进行统计学分析。结果 136株耐药结核分枝杆菌中北京型占54.41%(74/136)，非北京型占27.94%(38/136)，新发现基因型占17.65%(24/136)。北京型中包含SIT1和SIT269两种基因型，占比分别为52.94%(72/136)、1.47%(2/136)。在非北京型中，T型（T1、T2、T3）占21.32%(29/136),U型占6.62%(9/136)。基因分型聚类分析结果：分为北京型和非北京型两个大类以及一些散在的新型基Pidnarulex作用因型。Spoligotyping分型成簇分析结果：136株耐药菌株分为3簇，成簇率为75.74%(103/136)。北京型和非北京型的单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药比率分别为41.89%(31/74Enteric infection)、13.51%(10/74)、24.33%(18/74)、20.27%(15/74)和36.84%(14/38)、15.79%(6/38)、26.32%(1LGK-974体内实验剂量0/38)、21.05%(8/38)，经过卡方检验，北京型和非北京型两者之间以上各耐药率差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 海南省结核分枝杆菌基因型呈基因多态性，其主要流行菌株基因型为北京型中的SIT1型，应加强该基因型结核分枝杆菌监测工作。

镉(Cadmium,Cd)是常见的环境重金属污染物之一,长期暴露会导致人体多组织器官损伤。其半衰期长达十几年,是目前已知最易于在体内蓄积的有毒物质。由于镉污染的危害性及普遍性,生物防治是重要的举措。镉毒性机制得到广泛的研究,但氨基酸等营养素对细胞耐受性的影响、尤其分子机制并不明确。本文以酿酒酵母作为细胞模型,深入探究含硫氨基酸的代谢调控参与缓解细胞镉毒害的分子机制。首先,我们发现外源含硫氨基酸的加入可以部分回补野生型酿酒酵母细胞对镉的抗性,其他氨基酸例如亮氨酸、谷氨酸、色氨酸等的加入没有出现类似表型。硫酸盐同化途径(SAP)是由细胞外的硫酸根进入细胞合成半胱氨酸、甲硫氨酸等有机硫化物的过程,对重金属的耐受起重要作用。文献结果显示镉胁迫能激活酵母细胞SAP,相关基因被上调。但是,我们的实验结果显示硫酸盐转运子相关基因缺陷sul1Δ、sul2Δ在镉胁迫条件下较野生型WT表现出生长优势。推测有两种可能,其一,sul1Δ、sul2Δ可能兼有镉离子转运功能,缺失后镉不能转运进细胞内,减少对细胞的毒害作用;其二,硫酸盐转运子相关基因缺陷可能代偿性的引起细胞半胱氨酸脱硫酶活性升高,促进还原态S~(2-)形成,与镉生成优选的解毒态硫化物。我们利用ICP-AES方法检测在不同镉浓度胁迫下野生型WT和sul1Δ、sul2Δ突变株镉吸收情况,数据显示三者间镉离子含量没有显著性差异。进一步实验表明sul1Δ、sul2Δ突变株硫化氢合成较WT增加,而且半胱氨酸可以促进细胞生成硫化氢,并且镉优先于铅离子和硫化氢结合;相反,合成硫化氢相关基因缺失突变met5Δ菌株,胞内硫化氢累积减少、对镉十分敏感;此外,外源加入硫化氢可以增强WT对镉的抗性。表明第二种推测是正确的,SAP途径中还原态S~(2-)相较于硫醇(SH)对抗镉毒更重要。其次,半胱氨酸是SAP途径重要产物和逆向调控剂,也是合成谷胱甘肽(GSH)的组分,两者可通过巯基(SH)与镉螯合解毒,GSH还能清除由镉产生的ROS产生抗性。但GSH参与抗镉的具体分子通路、受细胞氧化水平(还原型GSH和氧化型GSSG水平)影响的机制并不十分清楚。我们首先验证了GSH合成酶缺陷菌株gsh1Δ、gsh2Δ和液泡谷胱甘肽S-结合物转运蛋白缺陷型菌株ycf1Δ对镉胁迫表现敏感;外源GSH的加入可以部分回补前者gshΔ突变对镉的敏感表型,但几乎没有影响镉胁迫对ycf1Δ抑制,表明GSH与镉的螯合物(GS-Cd-SG)转运到液泡是解毒的关键步骤。镉胁迫(40μM半抑制浓度)与氧化剂(H_2O_2)处理对WT、gsh1Δ、gsh2Δ、cys3Δ、ycf1Δ有相似的生长抑制效应,与还原剂(DTT)处理结果相反,表明细胞氧化胁迫是镉毒的重要机制。内质网氧化还原酶ERO1p通过蛋白质二硫异构酶(PDI)促进二硫键的形成并参与维持内质网(ER)的氧化还原平衡。我们的实验结果显示在WT菌株过表达ERO1对镉胁迫变敏感,在gsh1Δ、ycf1Δ过表达ERO1基本没有改变菌株对镉胁迫的敏感性;外源GSH能明显提高除了ycf1Δ以外WT、gsh1Δ基因型细点击此处胞的耐镉性;外源DTT能明显提高WT菌株过表达ERO1对镉抗性,表明过表达ERO1提高了细胞的氧化水平促进由还原型GSH到氧化型GSSG,降低了细胞的抗镉作用。进一步检测WT菌株还原型GSH水平呈镉处理浓度提高显著降低;细胞脂质过氧化程度(MDA水平)加重,外源半胱氨酸和GSH有明显的回补作用;过表达ERO1有促进镉毒的细胞效应,也再次证明含硫醇(SH)的半胱氨酸和GSH含量以及细胞内氧化水平影响了酵母细胞的抗镉作用。最后,细胞的TOR通路是连接糖、脂、氨基酸代谢和蛋白质合成等生长过程的重要调控平台。我们研究发现TOR通路PIK相关蛋白激酶雷帕霉素靶标基因突变体VE-822纯度tor1Δ和其下游的效应因子核糖体蛋白的转录和生物发生基因缺失突变体sfp1Δ对镉胁迫表现出较野生型的生长优势,对比铜、铁等其他金属离子的抑制作用,tor1Δ、sfp1Δ对镉胁迫表现专一的抗性。推测:TOR通路通过其介导的含硫氨基酸代谢过程参与了细胞的抗镉作用。研究结果显示,含硫氨基酸限制培养基中,sfp1Δ、tor1Δ对镉的生长优势消失;外源雷帕霉素同样可以部分消除镉胁迫对WT生长抑制。我们验证了雷帕霉素处理抑制细胞TORC1激酶导致Sfp1p去磷酸化从细胞核向细胞质迁移的过程,同时也证实镉处理模拟了雷帕霉素诱导Sfp1-GFP核定位分散到胞质,外源半胱氨酸的加入会使得Sfp1-GFP重新定位在细胞核中。随后,我们又检测了Sfp1p下游的响应基因的表达情况,结果显示核糖体蛋白基因RPS11B在镉处理的条件下表达量下降,而硫化氢合成基因MET5表达量在镉处理条件下升高;进一步的生化分析数据显示,相较于野生型,sfp1Δ、tor1Δ细胞中还原态硫离子含量升高。以上数据与第一部分实验结果吻合,表明镉胁迫能激活SAP途径特别是诱导还原态S~(2-)累积,同时,TORC1介导的含硫氨基酸的代谢通路在细胞的抗镉作用中承担重要角色。总之,本文以酿酒酵母为细胞模型,探究了重金属镉胁迫、半胱氨酸等含硫氨基酸参与的SAP途径、TOR信号通路之间的调控关系。结果表明,镉胁迫能激活SAP途径和改变细胞的氧化水平诱导半胱氨酸等含硫氨基酸代谢的变化,TOR信号通genetic load路连接并协调了含硫氨基酸营养代谢和镉胁迫细胞生长抑制之间的关系。这些发现为镉高耐受菌株或植物的选育提供新的思路,为重金属生物防治提供理论基础。

采用DNA提取及PCR扩增技术，对30头皖南母牛的mtDNA D-loop区的全序列进行扩增与分析。利用Genbank数据库，下载国内外部分黄牛品种mtDNA D-loop区的全序列，再使用Clustalx、Dnasp5.0等生物软件，对其全序列进行比对和对单倍型多样度、核Erdafitinib苷酸多样度等展开分析。皖南牛mtDNA D-loop区序列长度均在962～1052 bp的区间内，共发现68个变异位点，其中单一信息位点共有18个，简约信息位点共有50个。构成13种单倍型，其单倍型多样性（Hd）的均值为0.6483，核苷酸多样性（Pi）的均值为0.0131，其序列之间核苷酸的差异平均数（kRaf抑制剂）为11.589,A、C、G、T碱基含量平均占比分别为33.26%,25.23%,13.39%,28.12%。通过遗传距离和N-J系统进化树得知，皖南牛和威宁黄antibiotic expectations牛、湘西牛、大别山牛和吉安黄牛亲缘关系较近。皖南牛的遗传多样性和群体变异程度较低。研究结果可为皖南牛遗传资源的保护开发提供科学依据和理论参考。

近年来,抗生素是临床治疗细菌感染的主要方法,但由于抗生素的过度使用导致细菌产生严重的耐药性。据报道,碲纳米材料可以hexosamine biosynthetic pathway破坏细菌细胞内的硫醇结构,并且在适当波长的刺激响应下,具有良好的光热性能和光动力性能。基于以上原因,本论文设计并制备出一种羽毛状硒碲异质结构纳米材料(TeSe),并通过静电吸附作用负载光敏剂吲哚菁绿(ICG),以构建光热治疗(PTT)和光动力治疗(PDT)协同作用的多功能抗菌治疗平台,并进一步探索其在治疗细菌感染方面的应用潜能。主要的研究内容如下:1.TeSe纳米材料的制备和表征。以亚硒酸钠(Na_2SeO_3)和亚碲酸钠(Na_2Te O_3)为前驱体,不同分子量的聚乙二醇(PEG)为表面活性剂,谷胱甘肽(GSH)为还原剂,采用水热法制备出羽毛状TeSe纳米材料。通过透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射分析(XRD)、X射线光电子能谱仪(XPS)、能量色散X射线光谱仪(EDS)等手段对样品进行一系列表征。结果表明,该方法制备出的TeSe纳米材料分散性良好,尺寸均一,约为190～200 nm。2.TeSe-ICG纳米平台的构建。以TeSe纳米材料为载体,通过静电吸附作用负载吲哚菁绿(ICG),CL13900试剂以增强其光热和光动力协同治疗效果。通过紫外-可见分光光度计(UV-vis)计算ICG的负载量并评估TeSe-ICG纳米材料的光热和光动力性能。结果表明,TeSe-ICG纳米材料在808 nm近红外刺激下,具有良好的光热转换效率和单线态氧(~1O_2)产生的能力。3.TeSe-ICG纳米平台的抗菌性能研究。通过革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)评估TeSe-ICG纳米材料的体外抗菌效果。通过建立小鼠创伤感染模型评估TeSe-ICG纳米材料的体内抗菌效果。体外抗菌实验数据表明,TeSe-ICG纳米材料在近红外激光照射下对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有有效的光杀伤,杀菌率均高达99%以上。小鼠体内抗菌实验数据表明,TeSe-ICG纳米材料对抑制小鼠伤口感染、促进伤口愈合也具有良好的治疗效果,在治疗10天后伤口愈合率达到98.1%。Adavosertib细胞培养总之,TeSe-ICG纳米材料通过PTT和PDT协同抗菌具有良好的效果,为治疗细菌感染提供了一种有希望的策略。

目的 探讨程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境细胞毒性caecal microbiotaT细胞中的表达及其临床意义。方法 回顾性选取2012年1月至2020年12月入复旦大学附属中山医院青浦分院接受手术治疗的HCC患者344例为研究对象，手术切除HCC患者的癌组织，免疫组织化学双染色法检测PD-1的表达，依据PD-1的表达中位数水平分为PD-1高表达和PD-1低表达，分析PD-1表达与临床病理参数的相关性，采用Kaplan-Meier方法计算总生存率和无进展生存率并绘制生存曲线，采用多因素Cox回归分析HCC的预后影响因素。结果 PD-1表达于HCC肿瘤浸润淋巴细胞的细胞膜和（或）细胞质上，肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1的高表达率为43.9%(151/344);HCC肿瘤组中PD-L1的阳性表达率为21.8%(75/344);HCC肿瘤浸润免疫细胞中PD-L1的阳性表达率为47.1%(162/344)；肿瘤浸润CD8~+T细胞高密度率为45.3%(156/344)。PD-1高表达与肿瘤组织学分级、肿瘤细胞PD-L1表达、CD8~+T淋巴细胞PD-L1表达、CD8~+T淋巴细胞密度有关（P<0.05）。PD-1高表达患者的总生存率为80.81%，明显低于PD-1低表达患者（88.95%），差异有统计学意义（P<0.05）。PD-1高表达患者的无病生存率为67.44%，明显低于PD-1低表达患者（84.30%），差异有统计学意义（P<0.05）。多因素Cox回归分析结果显示，肿瘤细胞PD-L1表达3-Methyladenine生产商、肿瘤浸润免疫细胞PD-L1表达、CD8~+T淋巴细胞密度均为影响肝细胞癌患者预后的危险因素（P<0.05）。结论 CD8~+T淋巴细胞中PD-L1具有较高的表达率，CD8~+T细胞PD-1高表达与肿瘤组织学分级、肿瘤细胞PD-L1表达、CD8selleck~+T淋巴细胞PD-L1表达、CD8~+T淋巴细胞密度、总生存率和无病生存率显著相关，可作为HCC患者辅助诊断和预测预后的指标之一。