achr抑制剂

背景:新型冠状病毒(SARS-CoV-2)自爆发性传播以来,迅速在国内外蔓延,对全球公共卫生安全造成了巨大威胁。它不仅会引起典型的呼吸系统症状,还会累及其他系统,导致机体出现一系列并发症。目前,还没有有效治愈COVID-19的方法,仅以支持和对症治疗为主。辅助蛋白ORF7a被认为是一种免疫调节因子,可引起显著的炎症反应,但对其与宿主之间的反应机制尚未完全明了。因此,深入研究ORF7a与宿主的相互反应机制,有助于为完整揭示SARS-CoV-2的感染机制奠定基础,为临床治疗方案提供新的思路。目的:(1)探讨SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a对细胞凋亡的影响。(2)探讨ORF7a是否通过与抗凋亡蛋白BclXL相互作用促进细胞凋亡及机制。(3)探讨ORF7a泛素化与干扰BclXL的关系。方法:(1)在HEK 293T细胞和Vero E6细胞中过表达ORF7a,通过免疫印迹实验(Western blot)及流式细胞术检测ORF7a对细胞凋亡的影响。(2)在HEK 293T细胞中转染表达ORF7a与BclXL,用免疫共沉淀实验(COIP)技术检测ORF7a与BclXL是否存在相互作用。对ORF7a序列进行分析,构建三个ORF7a突变体。在HEK 293T细胞中过表达ORF7a突变体与BclXL,用COIP技术检测ORF7a突变体与BclXL是否存在相互作用。(3)用Western blot及流式细胞术检测ORF7a突变体对细胞凋亡的影响,用共聚焦显微镜检测ORF7a及其突变体与BclXL是否存在共定位,以及检测ORF7a及其突变体的细胞内定位情况。(4)用Western blot及荧光定量PCR技术检测ORF7a及其突变体对内质网应激相关因子的影响。(5)用COIP检测ORF7a泛素化与干扰BclXL的关系。共聚焦显微镜检测ORF7a泛素化后在细胞内的定位情况。(6)用Western blot及流式细胞术检测ORF7a泛素化后对细胞凋亡及内质网应激相关因子的影响。结果:(1)HEK 293T细胞和Vero E6细胞中过表达ORF7a后,与对照组相比,其细胞凋亡率增高,凋亡蛋白表达增高,抗凋亡蛋白表达降低。(2)COIP实验显示ORF7a和ORF7a_(KAK)与BclXL存在相互作用。(3)免疫荧光显示,野生型ORF7a和ORF7a_(KAK)与BclXL共定位,并分散在细胞核周围;野生型ORF7a定位于内质网膜。(4)Western blot检测显示野生型ORF7aMedical alert ID上调内质网应激相关因子PERK,P-eIF2α和CHOP。(5)COIP实验显示与不表达泛素的情况相比,在存在K63泛素共表达的情况下,野生型和突变型ORF7a与BclXL的结合减少;突变的ORF7a阳性细胞共表达泛素改变了ORF7a在ER上的亚细胞定位。(6)ORF7a泛素化后,与没有泛素化的相比,其凋亡率降低,内质网相关因子表达下降。结论:(1)SARS-CoV-2 ORF7a通过C端残基Lys117和Lys 119与BclXL相互作用,并将BclXL引入内质网,PERK-elF2α-CHOP途径激活内质网应激,从而导致细胞凋亡。(2)ORF7a点击此处的泛素化减少了它与BclXL的Nirmatrelvir试剂相互作用,抑制了它在ER上的聚集,阻断内质网应激,挽救细胞凋亡。

抑郁症是影响冠心病发病与预后的独立危险因素,可加重冠心病病情。研究治疗冠心病合并抑郁症的药对更有利于阐述方剂配伍及作用机制。中医认为冠心病合并抑郁症病因病机为气滞血瘀、气虚血瘀、痰瘀互结、气阴两虚,现代医学认为其发病机制为炎症反应、自主神经功能失Prebiotic activity调、下丘脑-垂体-肾上腺轴活跃表达以及血小板激活,柴胡-芍药、瓜蒌-半夏、黄芪-川芎、人参-灵芝等药对可通过抑制炎症反应、调节神经-内分泌系统、抗血小板聚集与活化、抗细胞凋亡、调控信号通路及保护血管内皮等多种途径防治冠心病合并抑郁症。在今后研究中,应基于中医的理论基础,结合现代科研方法进一步明确冠心病合并抑郁症的发病机制,挖掘中医药作用新靶点,促进“双心病”临床遣方的应用和中药复方的研发。参考文献Dibutyryl-cAMP分子量4Alpelisib化学结构0篇。

目的 分析丙泊酚调控脊髓环磷酸腺苷/蛋白激酶A-磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白-脑源性神经营养因子(cAMP/PKA-CREB-BDNF)通路对大鼠神经元凋亡、坐骨神经阻滞效果的影响。方法 选取40只SPF级Wistar雄性大鼠，其中对照组、假手术组、低剂量组、高剂量组各10只，空白组不做任何处理，PEG300说明书假手术组进行手术处理和0.9%氯化钠溶液注射，低剂量组在假手术的基础上注射丙泊酚10 mg/kg;高剂量组注射丙applied microbiology泊酚30 mg/kg。结果 与空白组相比，假手术组、低剂量组、高剂量组SOD活性降低(P<0.05);MDA含量、海马神经元凋亡率、各时间点MPE、MPE均升高以及cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。与假手术组相比，低剂量组、高剂量组MDA含量降低(P<0.05);SOD活性、海马神经元凋亡率、各时间点MPE以及10、20、30、60、90、120 min时间点MPE均升高、150、180 min时间点MPE均降低(P<0.05);cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。与低剂量组相比，高剂量组MDA含量降低(P<0.05);SOD活性、海马神经元凋亡率、各时间点MPE以及150、180点击此处min时间点EPT均升高；10、20、30、60、90、120 min时间点EPT均降低，(P<0.05);cAMP、PKA、CREB、BDNF表达均降低(P<0.05)。结论 丙泊酚能够增强坐骨神经阻滞效果，降低神经元凋亡率，起保护作用可能与丙泊酚调控cAMP/PKA-CREB-BDNF通路有关。

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物，是我国农业的重要组成部分，不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料，而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而，这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍，多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机selleck合成遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性，已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来，该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面Duodenal biopsy临的挑战和问题，同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议，以期为后续研究提供思路，并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参Panobinostat浓度考。

红火蚁是一种危险性入侵生物，选择几丁质合成抑制剂(氟啶脲、氟虫脲)、保幼激素类似物(苯氧威、吡丙醚)、蜕皮激素类似物(甲氧虫酰肼、虫酰肼)3类6种昆虫生长调节剂，以毒饵法室内测定其对红火蚁工蚁的毒力。结果表明：以400 mg·kg~(-1)昆虫生长调节剂饵剂饲喂红火蚁工蚁1～3 d,部分工蚁出现行mouse bioassay动迟缓、呆滞现象，个体间相对分散；9 d后各处理中工蚁的校正死亡率为12.21%～8selleck抑制剂8.27%。其中，甲氧虫酰肼饵剂处理后工蚁的校正死亡率较高，达(88.27±1.84)%,显著高于其他处理，且LT_(50)较短，为3.3 d;氟啶脲和苯氧威饵剂处理次之，工蚁的校正死亡率分别为(77.75±2.99)%和(70.11±1.56)%,LT_(50)分别为4.3和4.8 d。质量分数高于900 mg·kg~(-1)的甲氧虫酰肼饵剂，以及质量分数高于500 mg·kg~(-1)的氟啶脲、苯氧威饵剂，selleck激酶抑制剂对红火蚁工蚁的毒杀作用显著增强，工蚁取食3种饵剂7 d的LC_(50)分别为23.689、79.665、99.768 mg·kg~(-1);通过时间-剂量-死亡率(TDM)模型分析可知，3种药剂对工蚁致死效应最强的时间段在取食饵剂后1～7 d。可见，蜕皮激素类似物甲氧虫酰肼、几丁质合成抑制剂氟啶脲和保幼激素类似物苯氧威对红火蚁工蚁有较强的毒力，且饲喂7 d内效果明显，在该虫防治中有较大的应用潜力。

目的:研究盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其生物膜的抑制作用和相关机制。方法:本研究采用微量肉汤稀释法检测盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)及最低杀菌浓度(MInimum Bactericidal Concentration,MBC)。应用时间杀菌曲线观察盐酸小檗碱对铜绿假单伯菌的杀伤情况,连续诱导耐药法检测盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌对的耐药突变诱导情况。利用96孔板构建铜绿假单胞菌生物膜,采用结晶紫染色和共聚焦激光显微镜观察盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌生物膜的抑制和分散作用。利用膜通透性实验、活性氧释放、胞内ATP检测等多种手段探讨盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的抗菌机制。应用红细胞溶血实验评估盐酸小檗碱的细胞毒性。在小鼠急性感染铜绿假单胞菌腹膜炎模型中,评估盐酸小檗碱在体内的抑菌效果。结果:盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌的MIC为128-256μg/m L,MBC在256-512μg/m L之间。与传统抗生素相比,盐酸小檗碱还具备细胞毒性低以及不易诱导耐药等特点。1MIC(128μg/m L)、1/2MIC(64μg/m L)、1/4MIC(32μg/m L)的盐酸小檗碱均ABT-263临床试验可以抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,同时,对铜绿假单胞菌生物膜具有较好的分散作用。q-RT-PCR结果显示128μg/m L盐酸小檗碱作用铜绿假单胞菌后NVP-TNKS656研究购买QS相关基因相对表达量(psla、pela、gaca、gacs、rlsr)均得到明显下调。1MIC(128μg/m L)、1/2MIC(64μg/m L)盐酸小檗碱均可破坏铜绿假单胞菌细胞膜、释放活性氧以及减少细菌胞内ATP等多种方式发挥着抗菌作用。在小鼠腹膜炎模型中,20mg/kg的盐酸小檗碱能够显著抑制铜绿假单胞菌的生长,表现出良好的杀菌活性,同时能够occult hepatitis B infection明显降低炎症因子IL-6的释放。结论:在本次研究中通过体内体外实验发现盐酸小檗碱对铜绿假单胞菌均表现出良好的抗菌活性。盐酸小檗碱可抑制铜绿假单胞菌生长,且靶向作用于细胞膜,通过提高细胞体内活性氧水平、降低细菌代谢水平等多种途径发挥对铜绿假单胞菌的抑菌作用。盐酸小檗碱可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,其可通过下调铜绿假单胞菌QS系统相关基因、生物膜相关基因的表达水平,实现对生物膜的抑制作用。盐酸小檗碱在小鼠腹膜炎感染模型中,表现出良好的抗菌效果和抑制炎症反应的作用,在急性腹膜炎感染治疗中具有较好的应用前景。

研究背景与目的:流行病学调查显示,我国冠心病的患病率及死亡率逐年升高,作为冠心病的重要诊疗手段,介入手术例数也呈逐年增加的趋势。目前冠心病介入首选穿刺入路为桡动脉入路,当桡动脉穿刺失败或不适用时首选替代途径为股动脉途径,但由于股动脉穿刺术后患者需严格卧床制动,对于患者来说舒适度较差,且术后大出血发生率较高,因而部分病人拒绝经股动脉穿刺行冠心病介入手术。经肱动脉入路行介入手术术后患者无需严格卧床制动,但临床多由于缺乏熟练操作者及术后病人肘关节活动致止血不良等因素造成其临床应用较少,且既往有研究表明通过对肘关节的有效制动可以缩短术后压迫时间并减少其术后并发症的发生。所以本研究旨在基于3D打印技术开发出一款具有良好生物安全性及力学性能的肘关节外固定支具,并初步评价其应用于经肱动脉行冠心病介入术后患者的疗效情况。材料与方法:1.材料生物安全性评价:(1)细胞regeneration medicine毒性试验:将0.2g/ml浸提比的支具及硅胶浸提液稀释至浓度为100%、50%、25%、12.5%作为试验组,然后将试验组以及阴性、阳性和空白对照组各100ul加入含生长情况良好的L929细胞的96孔板中,培养24小时后在显微镜下观察细胞形态及生长情况,然后以CCK-8比色法测定各组OD值。(2)皮肤刺激试验:将6只新西兰兔平均分为2组(支具组和硅胶组)各3只,备皮后24小时在对应部位敷贴支具块、硅胶块、阳性对照材料及阴性对照材料,24小时后揭下敷贴物并清洗干净残留物质,观察去除敷贴物后24h、48h及72h的对应部位皮肤情况。2.参照国家标准规范完成对不同镂空方式的力学性能检测,包括弯曲试验、压缩试验和冲击试验,确定最佳的镂空方式。3.重要参数确定:(1)选取20名健康志愿者先后佩戴肘关节屈曲0°、30°和屈曲45°的肘关节外固定支具12小时后回收舒适度评价表,确定最舒适的肘关节屈曲角度;(2)选取20名健康志愿者分别佩戴不垫硅胶垫和垫不同厚度硅胶垫(3mm、5mm、8mm)的肘关节外固定支具各12小时,比较各组舒适度及红肿压痕、水疱的差异,确定最佳的硅胶垫厚度。4.通过软件处理将CT数据转换为所NSC125066临床试验需要的CAD数据,并通过3D打印机采用熔融沉积成型工艺打印出所需的肘关节外固定支具。5.临床初步应用:选取经皮肱动脉穿刺行冠心病介入术后患者共40名,随机分为试验组/支具组和对照组/传统组,随访观察患者术后24h内的穿刺点压迫时间、疼痛程度、及相关并发症等指标,比较两组间的差异。结果:1.(1)细胞毒性试验:显微镜下观察100%支具组、50%支具组、25%支具组、12.5%支具组、100%硅胶组、50%硅胶组、25%硅胶组、12.5硅胶组细胞生长情况良好,与阴性对照和空白对照组比较未见明显增殖下降情况。阳性对照组细胞密度较其他组明显下降,可见细胞圆缩及溶解。CCK-8检测提示阳性对照组的OD值较空白对照组明显下降,差异具有显著统计学意义(P<0.01);100%支具组、50%支具组、25%支具组、12.5%支具组、100%硅胶组、50%硅胶组、25%硅胶组、12.5%硅胶组及阴性对照组的OD值与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)皮肤刺激试验:在兔子取下敷贴物后24h、48h和72h分别对其敷贴部位进行观察,阳性对照部位可见明显红肿,部分伴焦痂形成;支具组、硅胶组及阴性对照部位未见明显红斑水肿。皮肤刺激评价,阳性对照部位皮肤反应类型为重度;支具组、硅胶组及阴性对照部位皮肤反应类型为极轻微。2.力学性能检测:弯曲试验:矩形镂空的最大载荷及弯曲强度较圆形和三角形镂空均更大(P<0.01);压缩试验:矩形镂空的最大载荷和压缩强度均比圆形和三角形镂空更大(P<0.01);冲击试验:圆形与矩形镂空的冲断试样时所消耗的功相比,差异没有统计学意义(P>0.05),但均较三角形镂空所消耗的功更多(P<0.05)。3.20名健康志愿者右上肢佩戴肘关节伸直位即肘关节屈曲0°,以及屈曲30°和45°的外固定支具各12小时,结果显示肘关节伸直位时舒适度较肘关节屈曲3PUN30119溶解度0°和屈曲45°均更差(P<0.01),肘关节屈曲30°和屈曲45°时患者舒适度差异无统计学意义(P>0.05);20名健康志愿者右上肢佩戴肘关节外固定支具时内衬加垫3mm、5mm、8mm厚度的硅胶垫及不垫硅胶垫(0mm)共12小时,对其舒适度及上肢红肿、压痕、水疱等情况进行统计分析,结果显示舒适度随硅胶垫厚度增加而增加,不垫硅胶垫舒适度较加垫3mm硅胶垫的舒适度更差,差异有显著统计学意义(P<0.01)。垫3mm硅胶垫的舒适度较垫5mm硅胶垫的舒适度更差,差异仍有统计学意义(P<0.05),加垫5mm硅胶垫与8mm硅胶垫的肘关节外固定支具舒适度差异无统计学意义(P>0.05);在红肿压痕方面,不垫硅胶垫与加垫3mm硅胶垫相比,差异无统计学意义(P>0.05),垫3mm硅胶垫较垫5mm硅胶垫的红肿、压痕情况更明显(P<0.01),垫5mm硅胶垫与垫8mm硅胶垫的红肿压痕情况相比差异无统计学意义(P>0.05),各组均未出现水疱;4.对支具组和传统组两组患者的一般临床资料进行比较,两组间性别、年龄、吸烟、饮酒、围术期抗血小板及抗凝药物使用情况的差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。两组患者术后穿刺点压迫时间支具组短于传统组(P<0.01);传统组术后24小时内的手臂疼痛程度较支具组明显(P<0.01);传统组术后患者上臂肿胀程度较支具组明显,差异有显著统计学意义(P<0.01);两组患者在术后前臂肿胀程度、皮下出血面积、出血分型、神经损伤、骨筋膜室综合征及彩超检查相关指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.本试验所用3D打印肘关节外固定支具材料及硅胶材料无细胞毒性和皮肤刺激性,具有较好的生物安全性。2.矩形镂空的力学性能最佳。3.佩戴肘关节屈曲30°及45°时舒适度更佳,考虑到肘关节屈曲角度对血管压迫器位置的影响,将肘关节外固定支具屈曲角度确定为30°;加垫5mm及8mm层厚硅胶垫的肘关节外固定支具舒适度最佳,为减轻病人负重的同时节约成本,将硅胶垫厚度确定为5mm。4.3D打印肘关节外固定支具可减轻经皮肱动脉穿刺行冠心病介入术后患者的疼痛程度,提高患者舒适度,并缩短穿刺点压迫时间,减轻上臂肿胀程度。

目前,癌症仍是威胁人类生命和健康的重要疾病之一。尽管传统的癌症治疗技术,例如手术切除、药物化疗、放射治疗等,提高了部分患者的生存率,但是由于肿瘤的复杂性和多变性,这些治疗方式仍不足以满足所有病人的需求。近年来,随着纳米技术的飞速进步,易于改性及功能化的纳米材料因其小尺寸效应、生物相容性和实体瘤的高渗透长滞留效应(enhanced permeability and retention,EPR)等独特优势被逐渐运用到肿瘤治疗中,并开发了一系列基于纳米技术的肿瘤治疗模式。声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)是一种利用超声波能量激活富集在病灶部位的声敏剂产生活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)来杀死细胞的新型肿瘤治疗模式。与传统的光动力疗法相比,声动力疗法安全性高、具有良好的组织穿透能力,可以对肿瘤深部组织进行治疗。近年来,研究人员开发了各种类型的声敏剂用于SDT治疗肿瘤,并取得了一些满意的治疗效果。其中,无机纳米材料因其稳定性高、易于功能化、具有良好的生物相容性等特点,受到了研究者们的广泛关注。然而,大多数无机纳米材料受到本身结构的限制,导致声催化效率较低,需要通过其他策略来提升声动力性能。结合近年来的研究结果表明,依靠单一的治疗模式难以取得理想的疗效,所以通过多种治疗手段联用的多功能纳米平台已经成为肿瘤治疗的研究重点。在本论文中主要围绕发展新型声催化无机纳米材料用于声动力治疗研究。通过不同的策略来增强无机纳米材料的声敏化性能,并联合其他治疗手段,构建了用于声催化介导的多功能纳米复合治疗平台。主要研究内容包括以下两部分:(1)通过水热法合成了具有中空介孔的二氧化钛(TiO_2)纳米球,并将非金属氮化碳量子点(g-C_3N_4 QD)表面沉积到TiO_2上,随后封装化疗药物罗米地辛(Z-IETD-FMK浓度Romdepsin,RMD),最终形成了基于异质结构负载RMD的可超声激活的多功能纳米反应器(TCR),实现了声动力和化疗的联合疗法。后续通过各种体外表征手段评估各项理化性质。在细胞水平上,利用小鼠乳腺癌细胞探究TCR纳米复合材料产生ROS能力,通过实验结果表明该纳米复合材料在声动力治疗与化疗的联合作用下对肿瘤细胞显示出明显的毒性作用,诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡。同时,能够有效触发免疫原性细胞死亡。通过尾静脉注射后,TCR能通过medical equipmentEPR效应在肿瘤区域被动高效富集,在超声作用下产生ROS及控制RMD的释放,以此实现肿瘤的联合治疗。通过免疫检查点抑制剂(PD-L1抗体)联合治疗,可以有效抑制远端转移瘤及肺部转移,显示出优异的抗肿瘤能力。(2)有研究表明缺陷型无机纳米材料在保持良好生物相容性的同时,可以提升传统无机纳米材料的性能,增强其声催化的效率。由此我们通过二次煅烧的方法合成了一种具有声动力性能的铁锚定氮缺陷型纳米催化剂(FeN_v/CN)。然后通过体外结构表征及化学探针证实该缺陷型纳米催化剂的声敏化效率及催化性能,发现由于缺陷引起的能带Colforsin结构变化,增强了声动力产生ROS的能力。后续通过在表面修饰聚乙二醇(PEG)以及共价偶联小分子穿膜肽(cRGD),增加其血液循环时间以及主动靶向肿瘤的能力,得到了最终负载cRGD的缺陷型纳米复合材料(FPR)。随后通过细胞层面证实了在cRGD的存在下提高了细胞摄取能力。伴随着超声及催化产生大量ROS并消耗GSH,产生细胞毒性,并抑制谷胱甘肽过氧化物酶活性,破坏癌细胞内氧化还原平衡,最终导致脂质过氧化物累积,诱发铁死亡。通过体内实验结果表明,这种治疗方式可以诱导癌细胞发生免疫原性死亡,从而抑制肿瘤发生。该纳米平台可以有效提高肿瘤的治疗效果。

脓毒症是可证实的或怀疑的感染诱发的失调的宿主反应引起致命性的器官功能障碍,严重时可以致残甚至死亡。近几十年的证据显示全世界脓毒症发病率居高不下,尤其是ICU人群。尽管伴随着近几十年的医学进步,对于脓毒症的理解逐步深入,治疗也取得了较大进步,但报道的死亡率仍高达40%。脓毒症心功能障碍(sepsis-induced cardiac dysfunction,SICD)是脓毒症常见的并发症,表现为与冠脉血管支配区不匹配的可逆的心脏收缩功能障碍和或舒张功能障碍。SICD的患者死亡率可增加2-3倍,文献报道为70-90%。SICD的确切发病机制目前仍不清楚,并且临床缺乏有效的治疗措施。研究认为失衡的炎症反应和氧化应激产生心肌抑制因子,诱发Ca~(2+)调节紊乱、β肾上腺素能失衡、线粒体功能障碍、能量代谢改变,以及这些改变又反过来加重炎症反应和氧化应激失衡等均参与了心肌抑制、损伤及部分坏死,导致心脏功能障碍,但基于这些机制的干预在临床研究显示出的治疗价值有限,仍需要进一步的研究来深入的理解其发病机制,发掘有效治疗,以改善患者的预后。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS),包括经典RAAS途径和非经典RAAS途径。两种途径在心脏的多种类型细胞均有表达。血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)是经典RAAS途径的主要效应分子,具有促炎效应,可以诱发心肌肥大、纤维化和心室重构,最终导致心功能障碍。血管紧张素1-7(angiotensin 1-7,Ang 1-7)是非经典RAAS途径的主要效应分子,具有与Ang点击此处 II相反的效应,因而具有抗炎和心脏保护作用。脓毒症时RAAS系统经典途径激活,Ang II显著增高,上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1),参与含pyrin域的NOD样受体家族蛋白3(nucleo-tide-binding domain,leucine-rich-repeat containing family,pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体激活,诱导白细胞浸润、微血管障碍和并参与脓毒症器官损伤包括心脏功能障碍。在脓毒症动物模型中,平衡RAAS系统可以控制过度的炎症反应,改善心功能和生存率。血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2),血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)的同源物,可以将具有促炎效应的Ang II裂解为具有抗炎效应的Ang 1-7,负向调节经典RAAS,对心脏有保护作用。重组人血管紧张素转换酶2(recombinant human ACE2,rh ACE2),已经被证实在炎性和非炎性心脏损伤模型中有心脏保护作用。而且出于安全的考虑,在rh ACE2对于急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者的临床试验中不仅显示出肺脏保护作用,还被证实对血流动力学没有抑制作用,可以被脓毒症ARDS患者和健康志愿者很好的耐受。NLRP3炎性小体,包含三个组成部分,分别是凋亡相关棘样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、NLRP3和天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)前体,是介导固有免疫反应的重要途径,研究显示NLRP3炎性小体激活参与了SICD发生发展。研究显示Ang II可以通过核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)激活NLRP3炎性小体。因此,本研究旨在观察SICD患者Ang II血浆水平与SICD发生的相关性和对脓毒症患者预后的影响。采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射的方法建立小鼠SICD模型,探讨SICD小鼠血浆Ang II的变化;应用rh ACE2调控SICD小鼠的血浆Ang II浓度,观察对炎症反应、心肌损伤和左心收缩功能的影响,并进一步探究调控Ang II对SICD小鼠心肌NLRP3小体激活及下游效应和相关分子信号途径的影响,为深入理解SICD的发病机制及和探寻新的治疗方向提供理论依据。第一部分脓毒症患者血管紧张素II水平与脓毒症心功能障碍的相关性分析目的:观察SICD患者、无心功能障碍的脓毒症患者及非脓毒症患者血浆Ang II水平的差异,探讨脓毒症患者Ang II血浆水平变化特点及其与SICD的相关性。方法:入选2022年2月至2023年2月沧州市中心医院三家ICU脓毒症患者,根据是否发生SICD,分为脓毒selleck症组和SICD组,选择同期入住ICU的非脓毒症非心衰脑卒中患者为对照组。收集入组患者的基线临床资料;测定患者入院后第一个清晨的血浆Ang II和炎症因子水平包括IL-1β和TNF-α。床旁超声心动图测定心功能指标包括LVEF、LVFS和E/A。采用独立样本t检验、行列卡方检验、单因素方差分析或非参数检验,Pearson或Spearman相关性分析,二元Logistic回归分析等对数据进行统计学分析。结果:1.研究期间连续入组符合脓毒症(sepsis 3.0)诊断标准的患者204例,排除不符合研究要求的患者,90例脓毒症患者纳入研究分析,其中54(60%)例未发生心功能障碍进入脓毒症组,36(40%)例发生心功能障碍进入SICD组。根据此研究排除标准随机筛选因脑卒中入住脑科院区EICU的非脓毒症非心衰患者20例作为对照。2.相比对照组,脓毒症组和SICD组患者均存在感染,PCT和WBC升高,APACHE II及SOFA评分更高,心率偏快,血压偏低,氧合指数偏低,乳酸和肾功能指标均偏高,ICU住院时间延长(P<0.05);相比对照组,脓毒症组和SICD组患者的Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度明显升高(P<0.001)。3.脓毒症组和SICD组患者的感染病因分布、PCT、WBC、氧合指数、肾功能指标和ICU住院天数均无组间差异(P>0.05);相比脓毒症组,SICD组患者APACHE II及SOFA评分更高,血压更低,乳酸更高(P<0.001)。4.与脓毒症组相比,SICD组患者LVEF显著降低,BNP、c Tn I、CK-MB显著升,Ang II、IL-1β和TNF-α血浆浓度显著升高(P<0.001或P<0.05)。相关性分析显示Ang II与c Tn I、BNP和IL-1β均有一定程度的正相关(r_s=0.5198,P<0.001;r=0.579,P<0.001;r_s=0.562,P<0.001)。5.相比脓毒症组,SICD组患者28天病死率显著增高(P<0.05),APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。小结:1.脓毒症患者Ang II水平显著高于非脓毒症患者。2.SICD患者的病情更重,ICU住院时间更长;SICD患者Ang II、IL-1β和TNF-α水平显著增高;脓毒症患者血浆Ang II水平与BNP和c Tn I、IL-1β水平呈一定程度的正相关。3.SICD患者28天病死率显著增高,APACHE II评分,BNP、Ang II和TNF-α血浆浓度,是否发生SICD均是脓毒症患者28天病死率的独立危险因素。第二部分脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素II血浆水平变化目的:应用LPS腹腔注射的方法制备SICD小鼠模型,验证SICD小鼠Ang II的血浆水平变化。方法:对健康清洁级成年雄性C57BL/6N小鼠,采用LPS10mg/kg腹腔注射诱导SICD。在LPS腹腔注射后3小时、6小时对小鼠进行左心功能评估,记录LVEF和LVFS。接受等容量生理盐水腹腔注射的小鼠作为对照。在LPS或生理盐水注射后6小时复查心脏超声后给予小鼠安乐死,采血收集血浆用于检测c Tn I、TNF-α、IL-1β和Ang II浓度,取心脏组织制作石蜡切片进行HE染色观察心肌组织病理学改变并进行半定量评分。采用配对或独立样本t检验用于分析相关参数的变化或组间差异。结果:1.LPS 10mg/kg腹腔注射可以成功模拟脓毒症的临床表现,在LPS腹腔注射后3小时小鼠出现精神不振,少动和进食水减少,炸毛,对外界刺激反应减弱,呼吸、心率加快,寒战,眼睛流脓,腹泻等。2.LPS 10mg/kg腹腔注射3小时后小鼠LVEF及LVFS较LPS 0小时显著下降(P<0.0001),LPS 6小时LVEF及LVFS进一步下降。LPS组小鼠在LPS注射后3小时和LPS注射后6小时的LVEF及LVFS均显著低于对照组(P=0.001;P<0.0001)。3.SICD小鼠表现出明显的心肌损伤,血浆c Tn I和组织形态学损伤评分较对照组显著增高(P<0.0001)。4.SICD小鼠血浆Ang II、TNF-α和IL-1β较对照组均显著升高(P<0.0001)。小结:1.剂量为10mg/Kg的LPS腹腔注射可以成功制备SICD小鼠,SICD小鼠LVEF及LVFS显著下降和心肌损伤明显。2.SICD小鼠TNF-α、IL-1β和Ang II血浆水平显著升高。第三部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的血管紧张素血浆水平、炎症反应以及减轻心肌损伤和心功能的影响目的:采用腹腔注射的方法对SICD小鼠补充rh ACE2,观察rh ACE2对SICD小鼠心肌损伤和左室收缩功能以及血管紧张素水平的影响。方法:预实验阶段选用两组不同剂量(100ug/kg和200ug/kg)的rh ACE2对LPS诱导心功能障碍成功的Hepatocyte-specific genes小鼠进行干预,发现200ug/kg rh ACE2对SICD小鼠心功能有显著改善。正式实验阶段,选取C57BL/6N小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+rh ACE2组(每组6只),在LPS注射后3小时超声心脏评估完成后立即分别给予3组小鼠用生理盐水、生理盐水和200ug/kg rh ACE2干预。LPS注射后6小时完成超声检查并记录LVEF和LVFS后安乐处死小鼠取血浆及心肌组织。应用酶联免疫吸附的方法测定血浆c Tn I、Ang II、Ang 1-7、TNF-α和IL-1β浓度。心肌组织制作石蜡切片,进行HE染色观察组织形态学改变,并进行心肌损伤半定量评分。结果:1.预实验显示rh ACE2 200ug/kg可以改善SICD小鼠的脓毒症表现和心功能(P=0.002)。因此,选取rh ACE2 200ug/kg进行后续实验研究。2.与对照组小鼠相比,LPS组小鼠出现明显的脓毒症表现,LPS+rh ACE2组小鼠脓毒症表现较LPS组减轻。3.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P<0.0001);而LPS+rh ACE2组小鼠LVEF及LVFS较LPS组显著改善(P=0.001)。4.LPS组小鼠血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.001),而LPS+rh ACE2组血浆c Tn I较LPS组明显减低(P=0.027);与对照组相比,LPS组小鼠心肌HE染色显示明显的组织形态学损伤,心肌损伤评分显著增加(P<0.0001),与LPS组相比,LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织形态学损伤及心肌损伤评分明显改善(P=0.003)。5.LPS组小鼠血浆Ang II(P<0.0001)和Ang 1-7(P=0.001)较对照组均显著升高。LPS+rh ACE2组Ang II血浆水平较LPS组显著降低(P=0.001),LPS+rh ACE2组Ang 1-7血浆水平较LPS组进一步升高(P=0.007)。6.LPS组小鼠TNF-α和IL-1β血浆浓度较对照组显著增高(P<0.0001);LPS+rh ACE2组小鼠TNF-α(P=0.011)和IL-1β(P=0.038)血浆浓度较LPS组明显控制。小结:1.应用rh ACE2可以减轻SICD小鼠的心肌损伤,改善左心收缩功能。2.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的Ang II血浆水平,进一步提高Ang1-7血浆水平。3.应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的TNF-α和IL-1β血浆水平。第四部分重组人血管紧张素转换酶2对脓毒症心功能障碍小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活及相关炎症因子和心肌细胞焦亡的影响目的:使用rh ACE2对SICD小鼠模型进行干预,对小鼠心肌组织进行蛋白分子分析和组织病理学检查,观察rh ACE2对LPS诱导的心功能障碍小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和细胞焦亡及促炎效应的影响,并探究其中可能的分子信号途径。方法:小鼠分组和干预与第三部分实验相同。血及心肌组织标本收集与保存方法与第三部分实验相同。应用ELISA方法检测血浆IL-1β和IL-18浓度;应用免疫印迹方法,检测心肌组织NLRP3蛋白表达水平和Caspase-1和GSDMD活化程度以及相关分子信号途径包括NF-κB,p38MAPK和AMPK-α1的激活情况;应用TUNEL染色方法,检测心肌细胞焦亡发生情况;采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用Least significance difference(LSD)或Tamhane’s T2检验。采用Pearson相关性分析探讨心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II浓度的相关性。结果:1.与对照组相比,LPS组心肌NLRP3蛋白表达、Caspase-1和GSDMD激活显著增高(P<0.0001);与LPS组相比,LPS+rh ACE2组心肌NLRP3蛋白表达(P=0.025)、Caspase-1(P=0.037)和GSDMD(P=0.006)激活明显受到抑制。2.与对照组相比,LPS组小鼠IL-1β和IL-18(两个依赖NLRP3炎性小体成熟的炎症因子)血浆水平显著增高(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠IL-1β(P=0.038)和IL-18(P=0.011)血浆水平较LPS组显著下调。3.心肌组织切片TUNEL染色显示,LPS组小鼠心肌组织细胞焦亡比对照组显著增多(P<0.001);而LPS+rh ACE2组心肌组织细胞焦亡比LPS组明显控制(P=0.001)。4.相关性分析显示心肌NLRP3表达与血浆Ang II水平呈显著正相关(r=0.884,P<0.0001)。5.LPS组小鼠心肌组织内NF-κB,p38MAPK途径激活较对照组显著增强(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内NF-κB(P=0.033),p38MAPK(P=0.001)激活较LPS组显著抑制;与此相反,LPS组小鼠心肌组织内AMPK-α1途径激活较对照组显著减低(P<0.0001),而LPS+rh ACE2组小鼠心肌组织内AMPK-α1激活明显恢复(P=0.014)。小结:1.应用rh ACE2可以抑制SICD小鼠的心肌NLRP3炎性小体激活,降低NLRP3炎性小体相关炎症因子IL-1β和IL-18水平,降低心肌组织内细胞焦亡,而抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径可能是其分子机制。2.NLRP3的心肌表达水平与Ang II的血浆浓度正相关,提示rh ACE2对NLRP3炎性小体激活的抑制效应,可能与其降低血清Ang II水平的作用相关。第五部分血管紧张素1-7受体阻断剂对重组人血管紧张素转换酶2在脓毒症心功能障碍小鼠中的心肌NLRP3表达的抑制效应和心脏保护作用的影响目的:应用Ang 1-7特异性Mas受体(Mas receptor,Mas R)阻断剂A779对接受rh ACE2治疗的SICD小鼠进行干预,观察A779对rh ACE2的SICD小鼠的心脏保护作用的影响,探究Ang 1-7血浆水平的变化是否参与了rh ACE2对SICD小鼠的心脏保护作用。方法:采用与第二、三部分相同的方法制备SICD小鼠模型。随机分为对照组、LPS组、LPS+rh ACE2组和LPS+rh ACE2+A779组(每组6只),LPS 3小时分别予生理盐水、生理盐水、rh ACE2及rh ACE2+A779干预。LPS 6小时行超声心动图检查后予安乐死,收集血浆及心肌组织。ELISA方法测定c Tn I血浆浓度,心肌组织石蜡切片进行HE和TUNEL染色,观察心肌损伤和心肌内细胞凋亡情况。应用免疫印迹方法测定心肌组织内NLRP3蛋白表达情况。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较三组间各指标差异,组间两两比较采用LSD(least significance difference,LSD)或Tamhane’s T2检验。结果1.LPS组小鼠LVEF及LVFS较对照组显著下降(P=0.003),LPS+rh ACE2组小鼠的LVEF和LVFS显著改善(P=0.016),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠LVEF和LVFS较LPS+rh ACE2组明显变差(P=0.028)。2.LPS组小鼠的血浆c Tn I较对照组显著增高(P=0.002),心肌损伤评分较对照组显著严重(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠的血浆c Tn I(P=0.033)和心肌损伤评分(P=0.008)较LPS组显著改善,而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的血浆c Tn I(P=0.04)和心肌组织形态学损伤以及损伤评分(P=0.015)较LPS+rh ACE2组明显恶化。3.LPS组小鼠心肌细胞焦亡较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh-ACE2组小鼠心肌细胞焦亡较LPS组显著减少(P=0.021),而LPS+rh-ACE2+A779组小鼠心肌细胞焦亡较LPS+rh ACE2组小鼠显著增加(P=0.031)。4.LPS组小鼠心肌NLRP3表达较对照组显著增加(P<0.0001),LPS+rh ACE2组小鼠心肌NLRP3表达较LPS组小鼠显著下降(P=0.03),而LPS+rh ACE2+A779组小鼠的心肌NLRP3表达较LPS+rh ACE2组显著增加(P=0.04)。小结:Ang 1-7特异性Mas R阻断剂A779不仅可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的NLRP3心肌表达和心肌细胞焦亡的抑制作用,还可以减弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和心功能的改善作用,提示rh ACE2在SICD小鼠中的心脏保护作用可能与其增加Ang 1-7的效应有关。结论:1.SICD患者的c Tn I和BNP较脓毒症组显著增高,病情严重程度显著加重,ICU住院时间和28天死亡率显著增高;SICD患者Ang II、AIL-1β和TNF-α血浆浓度显著高于脓毒症无心功能障碍患者,并与脓毒症患者发生心功能障碍和28天病死率增加相关。2.予C57BL/6N小鼠LPS腹腔注射可以模拟临床脓毒症症并成功制备SICD模型。SICD小鼠LVEF和LVFS下降,心肌组织病理学显示心肌损伤,心肌损伤标志物升高,并且SICD小鼠炎症因子水平和血浆Ang II、Ang1-7水平均显著升高,与本研究第一部分在脓毒症患者中的观察结果一致。3.SICD小鼠心肌NLRP3炎性小体激活和心肌组织内细胞焦亡显著增加。应用rh ACE2可以降低SICD小鼠的炎症因子水平,减轻心肌损伤和心脏收缩功能障碍,其机制可能是通过抑制NF-κB和p38 MAPK途径,增强AMPK-α1途径,从而抑制了心肌NLRP3炎性小体激活和后续的炎症反应放大和心肌细胞焦亡,发挥了心脏保护作用。4.应用rh ACE2显著降低了SICD小鼠的Ang II血浆水平。相关性分析显示心肌NLRP3蛋白表达水平与血浆Ang II水平具有一定程度的正相关,提示rh ACE2对SICD小鼠心肌NLRP3抑制效应与其降低Ang II水平的效应有关。5.A779,Ang 1-7特异性Mas R阻断剂,不仅可以减弱rh ACE2对NLRP3心肌表达和细胞焦亡的抑制作用,还可以削弱rh ACE2对SICD小鼠的心肌损伤和收缩功能障碍的改善作用,提示rh ACE2在SICD中的心脏保护作用与其增加Ang 1-7的效应有关。因此,rh ACE2治疗可以降低SICD的血浆Ang II水平,升高血浆Ang1-7水平,通过对NF-κB、p38 MAPK信号途径的抑制和对AMPK-α1信号途径的增强,可以抑制心肌组织NLRP3炎性小体激活,具有抑制炎症反应和心肌细胞焦亡,改善心肌损伤和心脏收缩功能的作用。

近年来,声称自己皮肤敏感的人群比例越来越高,主要表现为皮肤刺痛感、灼热感、痒感,这些症状的生理机制与皮肤屏障受损、皮肤神经感受异常、皮肤炎症有关。诱发敏感肌的因素很多,例如年龄、内分泌、气候、化妆品成分等等。其中,最常与皮肤接触的化学物质——表面活性剂对皮肤的刺激作用受到广泛关注和证实。因此,开发温和不刺激的表面活性剂原料是一种缓解敏感肌问题的解决方案。非致病酵母菌代谢得到的槐糖脂(SL)具有绿色温和、表面活性良好、独特生物活性等特质,可作为缓解敏感肌的一种天然原料,在个人护理及清洁领域具有很大潜力。然而,槐糖脂在国内大规模工业生产应用的实例很少,已被报道的提纯工艺较为复杂繁琐;关于槐糖脂生物活性的研究支撑数据相当少,需要进一步的机理探究。因此,本文研究了槐糖脂的提纯工艺优化及其针对敏感肌的抗炎舒缓功效,具体研究内容与结论如下:1.采用水洗法提纯发酵得到的SL,经过单因素筛选、正交优化后的水洗法提纯工艺为45℃下,p H为4,洗涤水添加量为1倍产物体积,水洗次数为3次。在此最优组合条件下,发酵液的蛋白脱除率为55.37%,糖脂损失率为9.90%。通过液质联用分析产物的组成结构,结果显示自制SL中酸型和内酯型的构型比例约为24:76,其中分子量为688的双乙酰化内酯型SL为产物的最主要成分。体外玉米醇溶蛋白实验及血红细胞溶血测试显示自制SL的超温和性,几selleck IDN-6556乎不与蛋白及细胞膜发生反应;透明质酸酶抑制实验的结果表明SL具备抗炎舒敏的潜力。2.建立LPS诱导的小鼠巨噬细胞体外炎症模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL抗炎的生物活性。结果显示SL能够显著减selleck PS-341少LPS诱导的炎症因子NO、IL-6、TNF-α的过度分泌,下调细胞内ROS、钙离子水平,降低i NOS、COX-2 m RNA的过度表达。同时,不同浓度的SL单独刺激细胞不会诱导细胞分泌额外的促炎因子,说明SL具有良好的抗炎活性。3.为了解释SL抗炎活性的具体机制,考察了SL对炎症反应中的关键转录因子之一NF-κB的调控作用。细胞免疫荧光染色实验的结果显示SL预处理可明显抑制LPS诱导的NF-κB核转录。此外,采用Western blotting法检测了SL对转录过程中p65和IκBα蛋白表达及磷酸化比例,结果显示不同浓度的SL预处理均能够抑制炎症引起的p65和IκBα的磷酸化过表达,降低磷酸化比例,说明在LPS诱导的体外炎症模型中,SL可以抑制炎症相关NF-κB通路的激活。分子对接辅助预测的结果表明,SL的作用靶点可能是Toll样受体复合物以及膜内激酶,从而阻止炎症信号的进一步传递。4.建立组胺诱导的体内小鼠瘙痒模型及体外角质细胞钙内流模型,在MTT细胞活力测试基础上,探究了SL舒缓皮肤瘙痒的生物活性。皮肤瘙痒刺激物组胺能够诱发小鼠的抓挠行为,行为学结果显示,SL对组胺引起的小鼠抓挠行为有抑制作用。小鼠抓挠部位皮肤的H&E染色图显示SL可以缓解皮肤瘙痒加剧后的屏障受损及炎症。利用荧光酶标仪、荧光显微镜,考察了SL对组胺诱导的Ha Ca T细胞钙内流的影响,结果表明不同浓度的SL预处理后,组胺诱导的钙内流被显著抑制。5.为了研究SL舒缓瘙痒的分子机制,首先利用钙的荧光标记,考察了在组胺刺激时SL与组胺H1或H4受体之间是否存在相互作用,结果表明SL可以通过与组胺H1、H4受体发生作用,抑制下游信号传导。此外,RT-PCR的结果显示,不同浓度的SL能够分别显著抑制组胺受体激活导致的PLCγ1、IP3R、PKCα信号分子基因的过度表达。为了进一步探讨SL抑制钙内Genetic compensation流的机制,研究了SL是否可以调控下游阳离子通道TRPV1的激活,结果显示SL能够下调TRPV1激活剂辣椒素诱导的钙内流。免疫荧光标记结果表明SL能够抑制辣椒素或组胺导致的TRPV1过度荧光表达,具有调节TRPV1通道活性的能力,分子对接预测结果表明SL可能通过相互作用的方式抑制刺激物激活TRPV1。