achr抑制剂

目的：观察通痹益脑汤联合常规西药治疗急性脑梗死患者的效果。PLX4032分子式方法：选取80例急性脑梗死患者为研究对象，按随机数字表法将其分为观察组（n=40）和对照组（n=40）。对照组行常规西药治疗，观察组在对照组基础上联合通痹selleck GNE-140益脑汤治疗holistic medicine，比较两组临床疗效、治疗前后中医证候积分、血流动力学指标[大脑前动脉（ACA）、大脑后动脉（PCA）、大脑中动脉（MCA）的平均血流速度]水平、格拉斯哥预后量表（GOS）分级和不良反应发生率。结果：观察组治疗总有效率为95.00%(38/40)，高于对照组的80.00%(32/40)，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，观察组中医证候积分低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组ACA、PCA、MCA平均血流速度均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；观察组GOS分级Ⅴ级占比率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：通痹益脑汤联合常规西药治疗急性脑梗死患者可提高治疗总有效率、血流动力学指标水平和GOS分级Ⅴ级占比率，以及降低中医证候积分，其效果优于单纯常规西药治疗。

第一部分FNDC5/鸢尾素通过促进肝星状细胞Rab27b泛素化降解进而抑制其外泌体释放目的:肝纤维化是肝脏对损伤刺激的异常修复过程MLN4924化学结构,其特征表现为肝星状细胞(HSCs)的活化和细胞外基质(ECM)的沉积。外泌体(EVs)作为细胞间通讯的关键媒介已被证实能够参与肝纤维化进程的调控。鸢尾素(Irisin)是由纤维连接蛋白Ⅲ型结构域包含蛋白5(FNDC5)裂解分泌的片段,是一种主要由骨骼肌释放到循环血中的肌动素。近期有研究发现Irisin可能参与了小鼠非酒精性脂肪肝肝纤维化进程的调控。然而,对于Irisin如何减轻肝纤维化及其分子机制、Irisin对活化HSCs外泌体释放及其调控机制目前尚不明确。为此,本研究观察了FNDC5/Irisin对HSCs基因表达谱的影响,并从外泌体释放的角度探索Irisin对活化HSCs的影响及其分子机制。方法:(1)从健康C57BL/6小鼠肝脏中分离出原代HSCs,使用Zetasizer Nano系列粒度仪通过动态光散射(DLS)分析外泌体的大小分布。(2)以三种不同处理方式(溶剂PBS、20ng/m L PDGF-BB、20ng/m L PDGF-BB+100ng/m L Irisin)处理原代小鼠HSCs 12h,采用超速离心法(Ultra-centrifugation)分离外泌体,采用纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测PDGF刺激活化的HSCs释放的外泌体大小、形态及数量,并采用蛋白免疫印迹(WB)检测外泌体区别于微囊泡的标记物TSG101和CD81的表达水平来进行验证;以观察Irisin对PDGF刺激活化的HSCs外泌体释放的影响。(3)提取各组HSCs的总RNA,使用Agilent生物频谱分析仪检测RNA,用Illumina m RNA Tru SEQ定向文库试剂盒生成RNA-Seq(转录组测序技术)文库,并使用Illumina Hi SEQ4000进行测序,以RNA-Seq测序筛选三种不同方式处理后的原代小鼠HSCs差异表达的基因谱,并采用基因集富集分析(GSEA)对相关信号通路进行富集分析,观察Irisin对PDGF-BB刺激活化HSCs基因表达谱的影响,探讨其调控的可能的机制及靶基因。采用WB验证三种不同处理后HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra和Pdgfrb蛋白的表达情况。(4)采用透射电镜(TEM)观察三种不同处理后的原代小鼠HSCs中的多泡体(MVB)及腔内囊泡(ILV)的形态和数量。采用CD63作为MVB的标记物进行免疫荧光(IF)技术分析三种不同处理后HSCs中MVB的亚细胞分布情况。用WB检测验证HSCs中CD63蛋白的表达情况。(5)采用蛋白质质谱分析(PMS)三种不同处理后的原代小鼠HSCs中Rab GTPase家族成员的蛋白表达,并以WB检测三种不同处理后HSCs中Rab27a和Rab27b蛋白表达情况,同时以实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)分析HSCs中Rab27a及Rab27b的m RNA表达水平。(6)采用蛋白合成抑制剂放线菌酮(50μg/m L CHX)、自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(10μmol/L Baf A1)和泛素蛋白酶抑制剂乳胞素(10μmol/L Lac)预处理小鼠原代HSCs 8h后,分别再采用20ng/m L PDGF-BB和20ng/m L PDGF-BB+100ng/m L Irisin处理12h,收集各组HSCs,以WB检测Rab27b蛋白表达。进一步采用免疫共沉淀(Co-IP)检测原代小鼠HSCs中Rab27b泛素化水平。结果:(1)Zetasizer Nano系列粒度仪通过动态光散射(DLS)分析发现原代小鼠HSCs释放的外泌体的平均直径约为100nm。(2)纳米颗粒跟踪分析(NTA)技术检测显示,与PBS对照组相比,PDGF-BB组中原代小鼠HSCs释放的外泌体的数量明显增多(P<0.05);而PDGF-BB+Irisin组与PDGF-BB组相比,HSCs释放的外泌体的数量明显减少(P<0.05);但不同处理组对外泌体的大小和形态均没有产生明显影响(P>0.05)。WB检测结果显示,与细胞裂解液对照相比,TSG101和CD81在外泌体中的蛋白表达水平显著升高,且在外泌体中没有检测到内质网蛋白钙连蛋白(Calnexin);与对照组相比,PDGF-BB组外泌体中TSG101和CD81的浓度明显升高(P<0.05);PDGF-BB+Irisin组外泌体中TSG101和CD81的蛋白表达较PDGF-BB组明显降低(P<0.05)。(3)RNA-Seq测序发现PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组间共存在3,611个表达明显差异的基因,其中1,556个基因下调,2,055个基因上调。KEGG通路分析发现,差异表达的基因主要在促炎症和促纤维化相关通路显著富集。以WB验证结果显示,PDGF-BB处理后的HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra和Pdgfrb蛋白表达水平均显著升高,但PDGF-BB+Irisin处理后仅逆转了HSCs及其释放的外泌体中Pdgfra表达的增加,而不影响Pdgfrb表达的增加。(4)采用透射电镜(TEM)观察显示,与对照组相比,PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组中HSCs内的MVB的数量和MVB中ILV的数量都显著增多(P<0.05);而PDGF-BB+Irisin组较PDGF-BB组HSCs内的MVB的数量和MVB中ILV的数量增多更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光(IF)结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组和PDGF-BB+Irisin组中每个HSCs的CD63阳性斑点数量均显著增多(P<0.05),而PDGF-BB+Irisin组较PDGF-BB组中CD63阳性斑点数量增多更为显著,差异有统计学意义(P<0.05)。WB检测结果也表明Irisin处理组的HSCs中CD63的蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。(5)蛋白质质谱分析(PMS)和WB检测的结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组原代小鼠HSCs中Rab27a和Rab27b蛋白表达水平明显升高(P<0.05),尤以Rab27b表达升高最为显著;与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组中Rab27b蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Rab27a表达降低不明显。然而,q RT-PCR结果显示,与对照组相比,PDGF-BB组的HSCs中Rab27a m RNA表达轻度升高,但差异无统计学意义(P>0.05),Rab27b m RNA表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组中Rab27a及Rab27b的m RNA表达水平没有明显变化(P>0.05)。(6)WB检测结果显示,无论是否采用PDGF-BB和PDGF-BB+Irisin处理,与对照组相比,CHX组和CHX+Baf A1组的HSCs中Rab27b蛋白表达水平明显降低(P<0.05),而CHX+Lac组与CHX组和CHX+Baf A1组相比,HSCs中的Rab27b蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。进一步Co-IP实验的结果显示,与PDGF-BB组相比,PDGF-BB+Irisin组、PDGF-BB+Lac组及PDGF-BB+Irisin+Lac组的HSCs中的Rab27b蛋白表达水平均明显高表达(P<0.05),而PDGF-BB+Irisin+Lac组与PDGF-BB+Irisin组和PDGF-BB+Lac组相比,HSCs中的Rab27b蛋白表达高水平更为显著(P<0.05)。这些结果表明Lac可以抑制Rab27b降解,而Baf A1则不能;并且无论Lac存在与否,Irisin处理组的Rab27b的泛素化水平均显著升高(P<0.05)。结论:(1)Irisin可以减少PDGF-BB诱导活化的HSCs来源外泌体释放,但对外泌体形态及大小不产生影响。(2)Irisin通过增加Rab27b的泛素化降解抑制HSCs内MVB中ILV的透膜过程,这可能是Irisin影响HSCs来源外泌体释放数量减少的分子机制之一。第二部分FNDC5/鸢尾素处理的活化肝星状细胞外泌体体外抑制受体肝星状细胞活化目的:目前有研究显示,HSCs来源的外泌体可能参与了肝纤维化的进程,但外泌体在这个过程中如何参与调控肝纤维化发展及Irisin处理后活化HSCs外泌体如何发挥作用目前尚不明确。因此本部分重点观察了活化HSCs产生外泌体被受体HSCs摄取的动态进程,并进一步探讨了活化HSCs来源的外泌体对于受体HSCs迁移能力的影响,探讨Irisin处理后的HSCs来源外泌体对受体HSCs活化的调控。方法:(1)按照第一部分方法从健康C57BL/6小鼠肝脏中分离出原代HSCs,通过不同处理小鼠原代HSCs获得不同组外泌体100μg(数量约为1×10~9个),用PKH26对其标记后,分别与小鼠原代HSCs(1×10~6个)共孵育1h、3h、6h,采用免疫荧光观察受体HSCs对外泌体的内吞作用情况。(2)将三种不同处理方式(溶剂PBS、20ng/m L PDGF-BB、20ng/m L PDGF-BB+100 ng/m L Irisin)处理小鼠原代HSCs12h后分离得到的不同组外泌体,分别取100μg(数量约为1×10~9个),与1×10~6个小鼠原代HSCs共孵育24h,收集各组HSCs,分别检测以下指标:(a)WB检测不同处理获得的外泌体对受体HSCs Pdgfra蛋白的表达情况。(b)qRT-PCR检测各组受体HSCs细胞外基质(α-SMA和CollagenⅠ)和炎症因子(TNF-α和IL-1β)相关的基因表达,验证不同处理活化HSCs来源的外泌体对受体HSCs活化的调控作用。(3)采用划痕实验观察不同处理获得的外泌体对受体HSCs迁移能力的影响,分别在0h、24h采取图像,采用Image J软件测量细胞边界距离。结果:(1)受体HSCs与PKH26标记的供体HSCs来源的外泌体分别共孵育1h、3h、6h,免疫荧光结果显示,外泌体在1h开始被受体HSCs摄取,3h后摄取明显增加,持续到6h达到最大,有时间依赖性。(2)当受体HSCs与三种不同处理方式处理的HSCs来源的外泌体共孵育时,与空白(Vehicle EVs)组相比,活化(PDGF-BB EVs)组外泌体处理的受体HSCs中Pdgfra的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与活化(PDGF-BB EVs)组比较,Irisin处理(PDGF-BB+Irisin EVs)组的受体HSCs中Pdgfra的蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。(3)q RT-PCR分析结果显示,与对照(Vehicle EVs)组相比,活化(PDGF-BB EVs)组受体HSCs的α-SMA、CollagenⅠ、TNF-α和IL-1β的m RNA表达显著升高(P<0.05);与活化(PDGF-BB EVs)组相比,Irisin(PDGF-BB+Irisin EVs)组受体HSCs的α-SMA、CollagenⅠ、TNF-α和IL-1β的m RNA表达显著降低(P<0.05)。(4)划痕实验结果显示,与对照(Vehicle EVs)组相比,活化(PDGF-BB EVs)组受体HSCs迁移能力显著提升(P<0.05);而Irisin(PDGF-BB+Irisin EVs)组与活化(PDGF-BB EVs)组相比,受体HSCs迁移能力明显降低(P<0.05)。结论:小鼠原代HSCs对活化HSCs来源的外泌体具有内吞能力,且有时间依赖性。Irisin处理的活化HSCs来源的外泌体也能够被受体HSCs摄取,并通过旁分泌方式显著抑制受体HSCs的活化,Irisin的这一作用可能与其外泌体调控受体HSCs Pdgfra信号转导及改变纤维化和炎症基因表达有关。第三部分腹腔注射FNDC5/鸢尾素通过调节肝内免疫细胞分布及炎症因子基因改善CCl_4诱导的小鼠肝纤维化目的:前期的研究已经表明,Irisin在体外可以通过调节活化HSCs内Rab27b蛋白泛素化,抑制活化HSCs外泌体释放;同时,Irisin处理的活化HSCs释放的外泌体可以通过旁分泌的方式抑制受体HSCs活化的作用。为探究Irisin在体内对小鼠肝纤维化有无改善作用,本部分通过构建野生小鼠和FNDC5基因敲除(FNDC5~(-/-))小鼠的肝纤维化模型,观察Irisin对CCl_4诱导小鼠肝纤维化改善作用及可能的作用机制。方法:野生小鼠和FNDC5基因敲除(FNDC5~(~(-/-)))小鼠各18只,分别随机分成三组:橄榄油对照组、CCl_4组、CCl_4~+Irisin处理组。橄榄油对照组小鼠每周2次腹腔注射等量的橄榄油,CCl_4组和CCl_4~+Irisin组小鼠每周2次腹腔注射0.01m L/g含10%CCl_4的橄榄油,连续8周造模。从实验第一周开始,CCl_4~+Irisin组小鼠在注射CCl_4的同时每天腹腔注射生理盐水配制的重组人Irisin 0.5mg/kg/d,在橄榄油对照组和CCl_4组小鼠同时给与等量的生理盐水腹腔注射。最后给药24h后,所有小鼠戊巴比妥(100mg/kg)麻醉处死,留取血液及全部肝脏。分离血清,取各小鼠肝右叶组织约3mm×3mm,4%中性甲醛固定,其余肝组织置﹣80℃冰箱保存。检测以下指标:(1)常规病理切片,HE、Masson、天狼猩红染色,观察各组小鼠肝脏病理学改变。(2)qRT-PCR和WB分别检测各组小鼠肝脏Rab27b和Pdgfra的m RNA及蛋白表达情况。(3)免疫荧光观察和WB检测各组小鼠肝脏细胞外基质蛋白α-SMA和CollagenⅠ的表达情况。(4)q RT-PCR检测各组小鼠肝脏细胞外基质蛋白α-SMA和CollagenⅠ以及炎症性细胞因子TNF-α和IL-1β的m RNA表达情况。(5)采用流式细胞术检测各组小鼠肝脏中CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞、M1(CD11c~+)型巨噬细胞、M2(CD206~+)型巨噬细胞的水平。结果:(1)在野生型小鼠中,HE、Masson、天狼猩红染色镜下病理形态学观察发现,CCl_4组小鼠肝脏与对照组比较有明显肝细胞脂肪变性,纤维结缔组织增生,出现明显肝纤维化表现;而Irisin处理组小鼠肝脏中肝细胞变性及纤维化程度较CCl_4诱导的小鼠明显减轻。在FNDC5~(-/-)小鼠中,CCl_4组小鼠肝脏与相应对照组而言,肝细胞脂肪变性及纤维化表现明显,且纤维化表现也明显较野生型CCl_4组小鼠严重;Irisin处理可明显改善FNDC5~(-/-)小鼠CCl_4诱导的肝纤维化,但改善程度不及野生型小鼠。(2)q RT-PCR检测结果显示,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,与橄榄油组相比,CCl_4组小鼠肝脏Rab27b m RNA和Pdgfra m RNA表达均明显升高(P<0.05);与野生型小鼠CCl_4组相比,FNDC5~(-/-)小鼠CCl_4组肝脏中Rab27b m RNA及Pdgfra m RNA表达升高均更加明显(P<0.05)。在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,CCl_4~+Irisin组肝脏中Rab27b m RNA表达与CCl_4组相比均没有明显变化(P>0.05),但是Pdgfra m RNA表达均较CCl_4出现明显下降(P<0.05),但仍高于对照组。WB检测结果显示,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,与橄榄油组相比,CCl_4组小鼠肝脏的Rab27b及Pdgfra的蛋白表达均明显升高(P<0.05),尤以FNDC5~(-/-)小鼠Rab27b升高更为明显。CCl_4~+Irisin组小鼠肝脏中Rab27b的蛋白表达水平与CCl_4组相比明显降低(P<0.05),且FNDC5~(-/-)小鼠下降更为明显;在野生型小鼠中CCl_4~+Irisin组小鼠肝脏的Pdgfra的蛋白表达水平与CCl_4组相比明显降低(P<0.05);而在FNDC5~(-/-)小鼠中,CCl_4~+Irisin组小鼠肝脏中Pdgfra的蛋白表达水平与CCl_4组相比无明显变化(P>0.05)。(3)免疫荧光结果显示,与橄榄油组相比,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠CCl_4组均可见纤维化标志蛋白α-SMA(红色)和CollagenⅠ(绿色)显著表达,尤以FNDC5~(-/-)小鼠明显;而在Irisin处理均能够显著降低这两种蛋白表达的荧光强度,但是FNDC5~(-/-)小鼠降低不如野生型。WB检测结果显示,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,CCl_4组小鼠肝脏的α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达与橄榄油组相比均明显升高(P<0.05);CCl_4~+Irisin组小鼠肝脏的α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达与CCl_4组相比水平均明显降低(P<0.05),但是,在FNDC5~(-/-)小鼠Irisin处理后对肝α-SMA和CollagenⅠ缓解程度不如野生型小鼠。(4)qRT-PCR的结果显示,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,与橄榄油组相比,CCl_4组可见小鼠肝脏α-SMA m RNA、CollagenⅠm RNA、TNF-αm RNA、IL-1βm RNA表达均明显升高(P<0.05);与CCl_4组相比,CCl_4~+Irisin组小鼠肝脏α-SMA m RNA、CollagenⅠm RNA、TNF-αm RNA、IL-1βm RNA表达均明显降低(P<0.05)。(5)流式细胞分选结果显示,在野生型和FNDC5~(-/-)小鼠中,与橄榄油组相比,CCl_4组小鼠肝脏中CD8~+T淋巴细胞的数量明显增加(P<0.05),CD4~+T淋巴细胞的数量明显减少(P<0.05);Irisin处理明显恢复CD4~+T淋巴细胞的数量减少,但对CD8~+T淋巴细胞的数量增加的逆转不明显。在两种小鼠中,与橄榄油组相比,CCl_4组小鼠肝脏中致炎M1(CD11c~+)型巨噬细胞数量明显增加(P<0.05),抗炎的M2(CD206~+)型巨噬细胞数量明显减少(P<0.05);Irisin处理明显恢复M2(CD206~+)型巨噬细胞数量明显减少和野生型CD11c~+巨噬细胞的数量增加,但在FNDC5~(-/-)小鼠Irisin对CD11c~+巨噬细胞的数量增加的逆转作用不明显。结论:(1)腹腔注射Irisin可以改善CCl_4诱导的小鼠肝纤维化进程,其机制可能与调节肝内免疫细胞分布,减少炎性相关基因表达,调控肝脏外泌体分泌有关。(2)体内FNDC5基因缺失可以进一步加快小鼠肝纤维化发展,且Irisin的治疗效果与体内FNDC5基因调控功能相关。第四部分FNDC5/鸢尾素通过调控HNRNP A1的稳定性及内质网应激进而抑制肝星状细胞活化和肝纤维化目的:内质网应激(ERs)及ERs激活的未折叠蛋白反应(UPR)已被证明是肝损伤、炎症和纤维化的驱动因素,也是急性和慢性肝病发展过程中常伴发的一个重要反应。有研究发现,ERs可以通过诱导异质核核蛋白A1(HNRNP A1)降解参与纤维化发展进程。在上面的研究中我们已经证实了Irisin对活化HSCs外泌体释放及肝纤维化进程的影响,但Irisin对HSCs活化中一个重要的环节ERs及HNRNPA1的表达调控目前尚不明确。因此,本部分的研究拟通过观察Irisin对HNRNP A1蛋白稳定性及ERs的调控,从ERs的角度探讨其改善肝纤维化的机制。方法:(1)体外培养小鼠原代HSCs,分别用100 ng/m L Irisin或等体积PBS处理HSCs 12d,每组设三复孔,于实验开始及第12d收集HSCs,提取蛋白,采用WB检测Irisin对HSCs的ERs相关蛋白GRP78、PERK及其磷酸化表达、CHOP的调控作用。(2)体外培养人肝星状细胞株LX-2,用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2h,再用2μg/m L衣霉素(Tun)共孵育12h,诱导细胞ERs,收集细胞,提取蛋白,WB检测PERK、p-PERK及HNRNP A1蛋白表达。(3)将FLAG-HNRNP A1转染进LX-2细胞,转染完成后用100 ng/m L Irisin及等体积的PBS分别预处理细胞2h,再以2μg/m L Tun共孵育12h,将细胞暴露50μg/m L CHX,在指定时间(0h、1h、3h和6h)收集细胞,免疫印迹WB法检测各时间点细胞HNRNP A1蛋白表达水平,绘制FLAG-HNRNP A1的半衰期曲线。(4)用Trans Fast转染试剂Lipofectamine 2000转染PERK过表达质粒入LX-2细胞,确定转染效能后,后用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2 h,然后再以2μg/m L Tun共孵育12 h,收集细胞,WB法检测各组LX-2细胞中p-PERK、PERK及HNRNP A1蛋白的水平。(5)用Trans Fast转染试剂Lipofectamine 2000将短发夹RNA(shRNA)HNRNP A1干扰序列(sh RNA-HNRNP A1)及其阴性对照序列sh RNA-NC转染入LX-2细胞。转染后用100 ng/m L Irisin或等体积PBS预处理细胞2h,然后再以2μg/m L Tun共孵育12 h,用免疫荧光染色检测LX-2细胞HNRNP A1和α-SMA的表达,并采用q RT-PCR检测LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I、TIMP-1m RNA的水平,用WB法检测LX-2细胞Collagen I、GRP78和CHOP蛋白表达水平。(6)取第三部分三种不同处理的野生型小鼠肝脏病理切片,采用免疫荧光染色的方法观察p-PERK、HNRNP A1、α-SMA在肝脏内的表达定位。(7)基于野生型小鼠和HNRNP A1~(-/-)小鼠,分别按照0.01m L/g体重腹腔注射溶于橄榄油的10%CCl_4,每周2次,共8周,构建CCl_4诱导的小鼠肝纤维化模型,从CCl_4注射的第一天开始,CCl_4~+Irisin组也每天腹腔注射生理盐水配制的重组人Irisin 0.5mg/kg/d,橄榄油对照组和CCl_4组小鼠也分别给与等量的生理盐水腹腔注射。实验结束后杀鼠取血及肝脏,常规病理切片,天狼猩红及Masson染色观察小鼠肝组织纤维化情况。采用WB检测各组小鼠肝脏中肝纤维化及ERs相关蛋白(α-SMA、Collagen I、GRP78和CHOP)的表达情况。结果:(1)与刚分离的小鼠原代HSCs(静止态)相比,培养12d HSCs(活化态)中GRP78、p-PERK、PERK和CHOP、α-SMA、Collagen I蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与培养12d小鼠原代HSCs相比,加Irisin处理HSCs中GRP78、p-PERK、PERK和CHOP、α-SMA、Collagen I蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。(2)WB检测LX-2细Bioconcentration factor胞p-PERK和PERK蛋白与HNRNP A1蛋白表达水平的结果显示,与对照组相比,Tun处理组中p-PERK和PERK蛋白表达水平Fulvestrant作用明显升高(P<0.05),HNRNP A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Irisin处理组中p-PERK和PERK蛋白表达水平较Tun处理组明显降低(P<0.05),HNRNP A1蛋白表达水平较Tun处理组明显升高(P<0.05)。(3)CHX处理后分析HNRNP A1蛋白的稳定性的结果显示,在对照组中,FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平随时间延长3 h开始降低,6 h出现明显降低;Tun处理组FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平1 h就开始出现下降,6h几乎消失,可见Tun处理加速了FLAG-tagged HNRNP A1的降解;而Irisin预处理组明显减缓了FLAG-tagged HNRNP A1的蛋白表达水平这一过程。(4)在Tun暴露条件下,LX-2细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平明显升高,HNRNP A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05),与前面结果一致;Tun+Irisin处理后LX-2细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平与Tun组相比明显降低,而HNRNP A1蛋白表达水平明显升高(P<0.05);转染PERK过表达质粒的LX-2细胞与Tun+Irisin处理组相比,细胞的p-PERK和PERK蛋白表达水平明显升高,HNRNP A1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。(5)细胞免疫荧光染色结果显示,Tun可以诱导LX-2细胞α-SMA表达,下调HNRNP A1的表达(P<0.05);Irisin处理能够有效抑制Tun诱导的LX-2细胞中α-SMA表达升高和HNRNP A1的表达降低(P<0.05)。但是,在转染sh RNA-HNRNP A1之后的LX-2细胞,Irisin处理抑制Tun诱导的LX-2细胞中α-SMA表达升高和HNRNP A1的表达降低的作用消失,其表现模式与Tun组一致。q RT-PCR结果显示,与对照组相比,Tun处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达显著升高(P<0.05);Tun+Irisin处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达与Tun处理组相比显著降低(P<0.05);转染sh RNA-HNRNP A1处理组LX-2细胞中TGF-β、α-SMA、Collagen I和TIMP-1的m RNA表达与Tun+Irisin处理组相比显著升高(P<0.05)。WB结果显示,与对照组相比,Tun处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与Tun处理组相比,Tun+Irisin处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Tun+Irisin+sh RNA-HNRNP A1处理组LX-2细胞中Collagen I、GRP78和CHOP的蛋白表达水平与Tun+Irisin处理组相比明显升高(P<0.05)。(6)组织免疫荧光染色检测结果表明,在野生型CCl_4组小鼠的肝脏组织中p-PERK和α-SMA表达水平及在HSCs中共定位强度显著高于橄榄油对照组小鼠;CCl_4~+Irisin处理组小鼠p-PERK和α-SMA的表达水平及在HSCs中共定位强度明显较CCl_4组减弱。野生型小鼠肝脏HNRNP A1与α-SMA共定位观察结果表明,与橄榄油组相比,CCl_4组小鼠的肝脏组织中HNRNP A1表达显著降低,而CCl_4~+Irisin处理组小鼠肝脏组织中HNRNP A1表达部分恢复,且与α-SMA在HSCs中共定位强度也有明显增加。(7)天狼猩红和Masson染色的小鼠肝脏病理组织学结果显示,在野生型小鼠可见CCl_4诱导明显肝纤维化,Irisin治疗可明显改善小鼠肝纤维化程度(P<0.05);而在HNRNP A1~(-/-)小鼠,同样CCl_4可诱导较野生型更为明显肝纤维化,且给与Irisin治疗后纤维化改善明显不如野生型小鼠(P<0.05)。WB检测结果表明,与野生型小鼠相比,HNRNP A1~(-/-)进一步诱导了α-SMA、Collagen I、GRP78和CHOP在CCl_4诱导的肝纤维化模型小鼠肝脏组织中的表达,而Irisin在HNRNP A1~(-/-)小鼠中对这些蛋白的抑制作用也显著弱于在野生型小鼠中效果(P<0.05)。结论:(1)Irisin可以通过抑制HSCs的ERs蛋白PERK介导的HNRNP A1蛋白降解,进而调控HSCs活化及细胞外基质产生而发挥其改善小鼠肝纤维化作用。(2)HNRNP A1是HSCs的ERs信号蛋白PERK的一种新的中间底物,也是Irisin发挥改善小鼠肝纤维化作用的一个关键蛋白。

目的 观察健脾利湿通络方治疗2型糖尿病合并高尿酸血症的临床疗效。方法 选择2020年1月—2021年7月于首都医科大学附属北京中医医院肾病科、内分泌科就诊的2型糖尿病合并高尿酸血症患者72例，根据随机数字表法分为治疗组、对照组各36例。2组均采用糖尿病规范化治疗，治疗组加服健脾利湿通络方，1剂/d，早晚分服；对照组加服苯溴马隆，50 mg/d,1次/d。2组疗程均为8周。对比2组中医证候疗效、尿酸（UA）疗效，比较2组治疗前后中医证候积分及空腹血糖（FBG）、餐后2小时血糖（2 h PBG）、糖化血红蛋白（HbA1C）GDC-0973体内实验剂量、UA、一氧化氮（NO）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素6 (IL-6)水平。结果 治疗组中医证候总有效率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）,UA总有效率2组差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组治疗后中医证候积分、FBG、2 h PBG、HbA1C、UA、XOD、hs-CRP、IL-6水平低于对照组（P<0.05）,NO水平高于对照组（P<0.Lung immunopathology05）。结论 与苯溴马隆相比，健脾利湿通络方治疗2型糖尿病合并高尿酸血症安全有效，其疗效机制可能与调控氧Protein Tyrosine Kinase抑制剂化应激和炎症反应有关。

目的 探讨糖尿病专科护士健康教育对慢性肝病合并血糖异常患者病情的影响。方法 选取2019年1月—2MLN8237体内020年5月于宜春市人民医院住院治疗的慢性肝病合并血糖异常患者86例作为研究对象，按随机数字表法分为2组，各43例。对照组给予常规住院教育，观察组由糖尿病专科护士实施健康教育，对比2组依从性、自我效能、血糖指标、血脂指标、护理满意度及并发症发生率。结果 干预前2组依从性评分、自我效能评分、血糖指标、血脂指标比较，无统计学差异（PDental biomaterials>0.05）；干预后观察组依从性及糖尿病管理自我效能量（DMSES）量表评分高于对照组，空腹血糖（FPG）、餐后2 PF-03084014 NMRh血糖（2 h PG）、甘油三酯（TG）水平、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平低于对照组，高密度脂蛋白（HDL-C）水平高于对照组，均有统计学差异（P<0.05）。观察组护理满意度高于对照组，并发症发生率低于对照组，均有统计学差异（P<0.05）。结论 糖尿病专科护士健康教育干预能够提高慢性肝病合并血糖异常患者依从性及自我效能，有利于稳定血糖水平，降低血脂，减少并发症，提升护理满意度。

目的 探究汉黄芩苷(WGPreformed Metal Crown)对高糖刺激下RAW264.7巨噬细胞的KLF4/NF-κB信号通路的影响。方法 培养RAW264.7巨噬细胞，CCK-8法检测WG对细胞无活性影响的浓度范围。将细胞随机分为LG组(5.5 mmol/L葡萄糖培养基)、D组(30 mmol/L甘露醇培养基)、HG组(30 mmol/L葡萄糖培养基)、LG+WG50组(5.5 mmol/L葡萄糖+50μmol/L WG)、HG+WG12.5组(30 mmol/L葡萄糖+12.5μmol/L WG)、HG+WG25组(30 mmol/L葡萄糖+25μmol/L WG)、HG+WG50组(30 mmol/VP-16作用L葡萄糖+50μmol/L WG);免疫荧光检测各组细胞iNOS的表达，Western blot检测各组细胞NF-κB p65、NF-κB pp65、KLF4、iNOS、IL-1β、TNF-α蛋白表达，qRT-PCR检测各组细胞KLF4、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表达量，ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β的分泌水平。结果 与LG组相比，HG组细胞中iNOS表达高(P<0.01),与HGMRTX849组相比，HG+W50组细胞中iNOS表达降低(P<0.01)。与LG组相比，高糖可以抑制KLF4的表达(P<0.01),上调NF-κB pp65、iNOS、IL-1β、TNF-α的表达(P<0.01),增加上清液中IL-1β、TNF-α的水平(P<0.01);与HG组相比，WG组各炎症指标明显下降(P<0.01),KLF4的表达量反而剂量依赖性增高(P<0.01)。结论 WG可以抑制高糖刺激巨噬细胞分泌炎症因子及相关蛋白的表达，有提高保护性因子KLF4的治疗作用。

目的：观察自拟益肾消痰通脉汤联合依那普利治疗高血压肾病（HN）患者的效果。方法：选取2019年10月至2021年8月该院收治的88例HN患者进行前瞻性研究，按照随机数字表法分为观察组与对照组各44例。对照组口服依那普利治疗，观察组在对照组基础上联合自拟益肾消痰通脉汤治疗，比较两组临床疗效、治疗前后叶酸水平、同型半胱氨酸获悉更多（Hcy）水平、肾功能指标[血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量、血清肌酐（Scr）和内生肌酐清除率（Ccr）]水平，以及不良反应发生率。结果：观察组治疗总有效率为95.45%，明显高于对照组的79.55%，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，两组血清叶酸水平均高于治疗前，且观察组高于对照组，两组Hcy水平均低于https://www.selleck.cn/products/dabrafenib-gsk2118436.html治疗前，且观察组低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后，两组BUN、Scr、24 h尿蛋白定量水平均低于治疗前，且观察组低于对照组，两组Ccr水平均高于治疗前，且观察组高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；两组不良反应发生率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：自拟益肾消痰通脉汤联合依那普利治疗HN患者可提高治疗总有效率bioheat equation和血清叶酸、Ccr水平，降低Hcy、BUN、Scr和24 h尿蛋白定量水平，效果优于单纯依那普利治疗。

背景 社区门诊老年患者常罹患多种慢性病，易被开具潜在不适当处方(PIP)。目的 分析社区门诊老年患者处方成为PIP的影响因素。方法 于2021年3月，采用整群抽样与简单随Core-needle biopsy机抽样相结合的方法，抽取2019-01-01至2019-12-31至北京市某社区卫生服务中心门诊就诊的老年患者的药物处方，由2名具有中级职称的药剂师分别依据美国老年医学会2019版Beers标准(简称Beers标准)及《中国老年人潜在不适当用药判断标准(2017版)》(简称中国标准)对处方进行评价，同时由研究者采集处方者、处方对象和处方内容相关资料，比较不同FUT-175评价结果处方在处方者、处方对象特征及处方内容上的差异。采用二元Logistic回归分析影响PIP开具的因素并进行敏感性分析(仅选取≥65岁患者的处方)。采用描述性分析法分析PIP中不适当用药的药品分布情况。结果 共纳入815张老年患者门诊处方，在Beers标准、中国标准下，分别有266张(32.6%)、182张(22.3%)处方为PIP。在Beers标准下：PIP与非PIP的处方者年龄，处方对象年龄，疾病诊断为高血压、失眠者占比，药物品种数，药物类别为心血管系统用药、抗血栓用药、中枢神经系统用药和胃肠道系统用药者占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)。在中国标准下：PIP与非PIP的处方者年龄、职称分布，疾病诊断为高血压、冠心病、糖尿病、失眠和骨关节炎者占比，药物类别为心血管系统用药、抗血栓用药、非胰岛素类降糖药、中枢神经系统用药和非甾体抗炎药者占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)。二元Logistic回归结果显示，无论在Beers标准还是在中国标准下：老年患者冠心病、失眠患病情况对PIP的开具有影响，处方中包含抗血栓用药是处方成为PIP的影响因素(P<0获悉更多.05)。敏感性分析结果显示：老年患者高血压、冠心病、失眠患病情况对PIP的开具有影响，处方中包含抗血栓用药是其成为PIP的影响因素(P<0.05)。在Beers标准下，266张PIP涉及不适当用药共302例次，其中抗血栓药物占46.4%(140/302)，中枢神经系统药物占16.2%(49/302)，内分泌系统糖尿病(非胰岛素)药物占13.9%(42/302)；在中国标准下，182张PIP涉及不适当用药共205例次，其中抗血栓药物占44.9%(92/205)，中枢神经系统药物占25.9%(53/205)，口服非甾体抗炎药物占14.1%(29/205)。结论 老年患者社区门诊处方中，PIP占比较高，今后应重视社区医生对安全、合理用药知识的掌握情况，规范抗血栓药物的使用，加强对高血压、冠心病及失眠患者药物处方的审查。

目的 观察清肝降压胶囊联合卡维地洛片治疗肝经郁热型高血压合并慢性心率增快患者的疗效及安全性。方法 选择2018年10月―2020年7月于中国中医科学院广安门医院心血管科门诊就诊的静MLN8237体内息心率>80次/min、肝经郁热型1、2级高血压患者122例，按照随机数字表法分为单药组和联合组。单药组予卡维地洛10 mg/次，2次/d；联合组在此基础上予清hepatic adenoma肝降压胶囊1.5 g/次，3次/d。2周后血压不达标的患者卡维地洛加量为20 mg/次，2次/d，疗程为4周。对比2组治疗前后血压、心率、中医证候评分及疗效、安全性。结果 治疗2、4周2组SBP、DBP、静息心率均较治疗前降低（P<0.05）；治疗4周联合组SBCH-223191体内P低于单药组（P<0.05）。治疗4周后，联合组血压达标率高于单药组（P<0.05）;2组心率达标率、卡维地洛加量患者比例比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后2组中医证候积分均较治疗前降低（P<0.05），且联合组中医证候积分低于单药组（P<0.05）。联合组总有效率高于单药组（P<0.05）,2组治疗后均未出现不良反应。结论 清肝降压胶囊联合卡维地洛可以提高合并慢性心率增快的肝经郁热型1、2级高血压患者的血压达标率，且改善患者的临床症状，疗效优于单纯卡维地洛治疗。

目的研究亚低温对小鼠神经母细胞瘤(mouse neuro-blastoma N2a, N2a)细胞氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)损伤时小泛素类修饰蛋白特异性蛋白酶3(sR428生产商mall ubiquitin-like modifier proteins specific protease 3, SENP3)表达的影响。方法体外培养小鼠N2a细胞并予以OGD/R处理,建立模拟大脑缺血/再灌注的OGD/R模型以及亚低温模型;将N2a细胞按照随机数字表法分为3组(每组5孔):假手术组(S组)、OGD/R组和氧糖剥夺/复氧+亚低温组(OGD/R+HT组)。细胞计数试剂盒(cell counting kit-8adult medulloblastoma, CCK-8)法检测OGD/R后N2a细胞活性,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放率检测OGD/R后N2a细胞毒性,Hoechst33258染色观察N2a细胞凋亡,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)分析SENP3 mRNA的相对表达量,Western blot法测定SENP3的蛋白水平。结果与S组比较,OGD/R组和OGD/R+HT组细胞存活率下降、LDH释放率升高、凋亡细胞数量增多、SENP3 mRNA的相对表达量和蛋白水平升高(P0.05);与ODG/R组比较,OGD/R+HT组细胞存活率升高、LDH释放率降低、凋亡细胞数量减少、SENP3 mRNA的相对表达量和蛋白水平降低(P0.05)。结论亚低温减轻N2a细胞OGD/R损伤机制与抑NN2211化学结构制SENP3的表达有关。

LBH589化学结构目的探讨基础肾功能不全是否与STEMI伴有室壁瘤的患者的病死率相关,luciferase immunoprecipitation systems血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C Cy-C)水平和Cy-C计算的eGFR来评估急性心肌梗死伴有室壁瘤患者的基础肾功能损害的总体预后的价值。方法回顾MRTX849分子式性临床病例对照研究,连续收集2011年1月到2012年12月间355例来自两家医院的急性心肌梗死患者,其中183例为单纯急性心肌梗死,172例为急性心肌梗死伴有室壁瘤患者。通过检测入院时血清(creatinine Cr)和Cy-C水平,并分别计算相应的肾小球滤过率,来评估心功能。通过x~2检验分析两组住院期间病死率的差别,并通过多因素回归分析,探讨基线肾功能损害和病死率的相关性。结果在全体患者中,住院期间总病死率是14.0%,在急性心肌梗死伴室壁瘤组为18.6%,单纯心梗组为9.8%(P<0.01)。多因素回归分析发现基线肾功能损害,包括以Cr为基础的计算的eGFR<60 mL/(min·1.73 m~2),或以CyC为基础计算的eGFR<60 mL/(min·1.73 m~2)都和这些患者住院期间病死率密切相关(OR0.13,95%CI0.02~0.7,P=O.02;OR 0.01,95%CI0.003~0.05,P<0.01)。而Cy-C为基础计算的eGFR来评估急性心肌梗死患者的基线肾功能,以及总体的预后价值均较敏感。结论基线肾功能损害在急性心肌梗死患者,特别是伴有室壁瘤患者中具有重要的预后价值。通过Cy-C计算的eGFR在评估急性心肌梗死,特别是伴有室壁瘤的患者中,具有更敏感的预后价值。