猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)的病原体。临床上仔猪感染PEDV会引起严重腹泻和脱水,此病的致死率极高。过去几十年里,随着病毒的不断进化与传播,PEDV对全球养猪业构成极大的威胁,带来了重大的经济损失。I型干扰素反应作为宿主细胞天然免疫反应的第一道防线和主EPZ-6438抑制剂要组成部分,能够在病毒感染初期限制病毒的生命活动,而病毒的主要目的是逃逸或拮抗干扰素反应。PEDV已经进化出多种机制来逃避或对抗宿主的免疫反应以确保其生命活动的正常进行,PEDV Nsp14蛋白是其中的一个关键蛋白,并且在寻找更多冠状biologic drugs病毒中Nsp10蛋白常常作为Nsp14蛋白的辅助蛋白增强其活性。有文献证实,PEDV Nsp14蛋白能够抑制宿主细胞I型干扰素反应,但其具体机制还未被完全揭示。本文旨在以下两个方面对PEDV Nsp14蛋白与Nsp10蛋白协同抑制宿主细胞I型干扰素反应的详细机制进行深度挖掘:(1)探究PEDV Nsp14蛋白对宿主I型干扰素反应信号通路的影响,以及Nsp14蛋白本身酶活性在抑制宿主细胞I型干扰素反应中发挥的作用,阐明其抑制宿主I型干扰素反应的分子机制。(2)探究并阐明PEDV Nsp10蛋白与Nsp14蛋白相互作用对宿主I型干扰素反应的影响及分子机制。本研究利用Western blot及RT-PCR技术检测IPEC-J2细胞中过表达Nsp14蛋白时I型干扰素信号通路关键蛋白的变化情况。冠状病毒的甲基酶活性在调节宿主天然免疫方面发挥着重要作用,并且PEDV Nsp14蛋白具有N7甲基转移酶活性区域。于是,本研究在IPEC-J2细胞中过表达N7甲基转移酶活性缺失的Nsp14蛋白后检测其对I型干扰素信号通路关键蛋白的影响,来探究Nsp14蛋白以及其N7甲基转移酶活性在调控宿主细胞I型干扰素反应中发挥的作用。然后,本研究利用分子克隆技术构建了PEDV Nsp10重组质粒,并且利用定点突变技术构建了与Nsp14蛋白相互作用的残基突变的Nsp10突变体质粒,随后将PEDV Nsp14蛋白分别与Nsp10蛋白以及Nsp10突变体蛋白共转染至宿主细胞中,利用Co-IP实验,Western blot及RT-PCR技术检测两个蛋白在宿主细胞中的相互作用情况,以及宿主细胞中I型干扰素信号通路关键蛋白的变化情况,来探究PEDV Nsp10蛋白与Nsp14蛋白协同作用于宿主细胞I型干扰素反应的分子机制。实验结果显示,PEDV Nsp14蛋白具有抑制宿主细胞IRF3蛋白与STAT1蛋白的磷酸化水平以及IFN-β与ISGs的转录水平的功能,并且当PEDV Nsp14的N7甲基转移酶活性缺失时,Nsp14蛋白对宿主细胞IRF3/IFN-β/STAT1/ISGs这条I型干扰素反应信号通路的抑制作用消失。当Nsp14蛋白与Nsp10蛋白同时存在时其抑制宿主细胞I型干扰素反应信号通路的能力更强,且Nsp10蛋白对此信号通路不产生影响。PEDV Nsp14蛋白与Nsp10蛋白在宿主细胞中存在相互作用,与野生型Nsp10蛋白对照组相比当Nsp10突变体蛋白(K43A,H80A)与Nsp14蛋白相互作用能力降低或消失时,Nsp10蛋白增强Nsp14蛋白抑制宿主细胞I型干扰素信号通路的能力也随之降低或消失。本研究表明,PEDV Nsp14蛋白具有抑制宿主细胞I型干扰素反应的功能,且此功能依赖其N7甲基转移酶活性。PEDV Nsp10蛋白具有增强Nsp14蛋白抑制I型干扰素反应的作用,且Nsp10蛋白的这一作用依赖于其与Nsp14蛋白之间的相互作用。本研究解析了Nsp14蛋白与Nsp10蛋白协同抑制宿主细胞I型干扰素反应的分子机制,鉴于Nsp14与Nsp10蛋白在冠状病毒中的保守性,本研究也可以为设计治疗其他冠状病毒感染的有效药物提供理论依据。