研究背景胆管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤。在肝胆管系统恶性肿瘤中胆管癌的发病率仅次于肝细胞癌。根据发病位置在解剖上的不同,胆管癌可分为肝外胆管细胞癌(Extrahepatic cholangiocarcinoma,ECC)和肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)。病毒性肝炎、寄生虫感染、原发性硬化性胆管炎、先天胆道解剖异常、胆管结石等是目前较为公认的胆管癌发病的危险因素。近年来在世界范围内胆管癌的发病率逐年上升,尤其在东亚地区胆管癌发病率明显高于西方发达国家。目前对于胆管癌最佳治疗方法是外科手术切除,但由于其发病隐匿且侵袭、转移能力强故多数病人在确诊时已处于晚期,这也就导致其治疗效果相对较差,人群中胆管癌患者的五年生存率仅有5%左右。因此积极探索寻找一种新颖、可靠且与胆管癌发生发展均有关的靶点基因就具有重要的现实意义。同时如若进一步探索出该基因对胆管癌发生发展的调控模式则可为胆管癌的分子诊断与靶向治疗提供更重要的参考。异戊烯化Rab受体1域家族(Prenylated Rab acceptor 1 domain family,PRAF)与癌症发生发展的相关性近年来受到越来越多研究者的关注。PRAF蛋白家族属于靶向性的GTP酶受体,它们广泛分布于细胞质、内质网、高尔基体以及线粒体中。PRAF2是PRAF家族的代表性蛋白,它包含异戊烯化的Rab受体以及四个跨膜结构域,且可作为内质网驻留蛋白参与参与内Decitabine使用方法质网-高尔基体运输和囊泡运输。现已证明PRAF2与多种恶性肿瘤(胃癌、肝癌、结直肠癌、皮肤鳞癌和神经细胞癌)的发生发展以及恶性程度有关,在癌细胞中它能够参与调控多种基因的转录与翻译过程,深刻影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。同时在细胞周期调控、非编码RNA的加工以及上皮间充质转换等过程中PRAF2也都发挥重要作用。但PRAF2对胆管癌恶性生物学行为的的影响尚未有报道。Notch通路及其非典型配体DLK1也被发现与恶性肿瘤的发生发展密切相关。其中DLK1作为一种跨膜蛋白以及印迹基因的表达产物,其研究方向起初多集中它对于细胞分化以及增殖的调节。随着研究的深入近年来也发现它们与机体干细胞调节、肿瘤发生发展以及肿瘤干细胞干性的维持等多个方面均有密切关联。Notch通路在进化过程中高度保守,在人体内它参与调控细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等多种生物学过程,也有较多的研究证实Notch通路在多种恶性肿瘤的发生发展过程中均起到了重要的调节作用,研究也发现DLK1表达改变会引起的Notch通路转导异常,且这一异常转导与胆管癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关。研究目的1.通过临床新鲜组织样本以及病理组织切片分析PRAF2在肝外胆管癌中表达情况,同时探讨PRAF2的表达与肝外胆管癌临床病理参数以及患者术后生存情况的相关性。2.通过人为敲低和增加胆管癌细胞系中PRAF2的表达水平观察研究PRAF2的表达对胆管癌细胞增殖、凋亡以及迁移侵袭能力的影响;通过肿瘤细胞成球实验分析PRAF2对于胆管癌细胞干性的影响。3.探寻PRAF2调控胆管癌恶性生物学行为的机制,探讨其能否作为胆管癌诊断的新标志物以及治疗的新靶点。研究方法1.通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reactive,RT-q PCR)以及蛋白免疫印迹(western blot,WB)的方法检测患者术后新鲜胆管癌及其对应的癌旁组织中PRAF2信使RNA(messenger RNA,m RNA)和蛋白的表达水平。通过免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)分析胆管癌患者术后病理样本中PRAF2的表达情况。收集统计纳入研究患者的性别、年龄、血管神经侵犯情况、淋巴结转移情况、T分期(按AJCC第八版标准划分)、肿瘤病理分化水平以及术后生存时间,统计分析PRAF2表达情况与这些临床病理参数之间的相关性以及各项临床病理指标对于患者术后生存情况的影响。2.通过RTBioactive material-q PCR和WB方法检测各胆管癌细胞系中PRAF2的表达水平,同时筛选出相对高表达和低表达的胆管癌细胞系并对其进行PRAF2的敲低与过表达操作。克隆形成实验以及CCK-8实验检测PRAF2表达对于胆管癌细胞增殖能力的影响。划痕实验以及Transwell实验分析PRAF2表达对胆管癌细胞迁移侵袭能力的影响。肿瘤细胞成球实验以及流式细胞术分析PRAF2对于肿瘤细胞干性的影响。应用敲低PRAF2表达的胆管癌细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,判断PRAF2对胆管癌细胞在体内增殖的影响。3.通过文献回顾筛选可能与PRAF2相结合的蛋白。随后利用ZDOCK软件、Py MOL软件以及免疫共沉淀(co-inmunoprecipitation,Co-IP)实验对蛋白互作结果进行验证。利用WB及回补实验探寻PRAF2对于靶蛋白以及下游通路的影响。4.通过CCK-8实验以及裸鼠移植瘤药物治疗模型判断靶向抑制PRAF2对胆管癌细胞的化疗敏感性的影响。研究结果1.肝外胆管癌肿瘤组织中PRAF2在m RNA以及蛋白水平均高于癌旁组织。PRAF2的高表达与淋巴结转移、血管侵犯、肿瘤分化程度以及T分期显著相关,且高表达患者的术后平均生存时间较低表达患者短。单因素分析显示血管侵犯、淋巴结转移、PRAF2表达水平高低、肿瘤病理分化水平以及肿瘤T分期可以作为肝外胆管癌患者的预后因子;多因素分析结果提示血管侵犯与否以及肿瘤病理分化水平是肝外胆管癌患者手术预后的独立影响因子。2.三株胆管癌细胞的PRAF2表达水平依次是,CCLP1最高QBC939其次Hu CCT1最低。敲低PRAFBMN 673价格2表达的CCLP1实验组相较于对照组其增殖、迁移及侵袭能力均降低且凋亡增加。过表达PRAF2的Hu CCT1实验组相较于对照组其增殖、迁移及侵袭能力增强。肿瘤成球实验提示PRAF2在体外能够促进胆管癌肿瘤干细胞微球的形成。体内实验证实敲低PRAF2的表达能够抑制胆管癌肿瘤的生长。3.结构预测以及蛋白互作结果提示PRAF2能够与DLK1结合且回补实验证实PRAF2可以通过结合DLK1进而介导调控Notch信号通路。4.CCK-8实验和裸鼠移植瘤实验证实靶向抑制PRAF2的表达能够增强胆管癌细胞的化疗敏感性。研究结论PRAF2在胆管癌组织中高表达且其表达水平与患者预后相关;PRAF2在体外能够促进胆管癌细胞的恶性生物学表型,在体内能够促进肿瘤生长;进一步的机制研究发现PRAF2能够通过与DLK1结合调控Notch信号通路且靶向抑制PRAF2能够增强胆管癌细胞的化疗敏感性。