地球自转导致24 h周期环境从而产生昼夜节律,几乎所有生物体都具有内源性的计时机制。昼夜节律调控分子机制最重要的发现是转录翻译反馈环(transcriptional translational feedback loop,TTFL)的分子调控Microlagae biorefinery模式。多个生物钟基因参与调节昼夜节律的转录翻译反馈环路。在果蝇中,TTFL中重要的一环是依赖于异二聚体转录因子复合物CLOCK(CLK):CYCLE(CYC)在白天与基因启动子区域特定元件结合,以激活反馈抑制基因period(per)和timeless(timDolutegravir)的转录。积累后,PER和TIM形成异二聚体,从细胞质转移到细胞核以抑制CLK:CYC介导的夜间转录活性。尽管某些生物钟分子因物种而异此网站,但这种基于转录翻译的负反馈回路的基本框架在几乎所有生物中都是保守的。在哺乳动物中,CLK:BMAL1异二聚体激活反馈抑制因子Per1/Per2和Cry1/Cry2。积累后,PER和CRY易位至细胞核以抑制CLK:BMAL1活性。但是,PER和CRY2对CLK:BMAL1的转录激活能力抑制的一些细节尚未完全了解,比如PER和CRY2是一定要形成复合物还是可以单独行使抑制功能?二者在昼夜节律调控中是否存在差异?鳞翅目昆虫的内在时钟分子机制与果蝇有所差异,其生物钟机制介于典型的果蝇和哺乳动物之间。本研究聚焦鳞翅目昆虫小菜蛾昼夜节律的分子机制,建立了小菜蛾昼夜活动节律监测系统,利用CRISPR/Cas9技术对生物钟基因Pxper和Pxcry2进行单基因和双基因敲除,利用体外体内基因功能研究和时间序列转录组测序分析等手段,重点阐明小菜蛾生物钟基因Pxper和Pxcry2介导的昼夜节律调控差异。主要研究内容和结果如下:(1)参考果蝇昼夜活动监测系统,建立小菜蛾昼夜活动节律行为监测体系。光照黑暗循环(LD)条件下,雄虫和雌虫都表现出夜间活动模式,活动在熄灯后1h内达到顶峰,在开灯后迅速下降。在26℃条件下,小菜蛾雌虫和雄虫在完全黑暗(DD)条件下的自由活动节律监测比较困难。在20℃条件下,雄虫更适合用于研究小菜蛾自由活动的昼夜节律。(2)分析比对小菜蛾基因组数据库,克隆小菜蛾关键生物钟基因Pxper和Pxcry2,并对其表达和体内外功能进行分析。发现小菜蛾存在1个PER样基因(Pxper)和3个CRY样基因(Pxcry1、Pxcry2和6-4 photolyase)。克隆测序确定了小菜蛾的Pxper和Pxcry样基因的准确序列信息,发现Pxper和Pxcry2基因在小菜蛾头部表达均存在明显节律变化,但节律表达的模式并不一致。Px CRY2而非Px PER或其他CRY样蛋白表现出对CLK:BMAL1转录激活能力的强抑制。小菜蛾Px PER的功能可能是物种特异性的,并不完全类似果蝇Dm PER的功能。Pxcry1而非Pxcry2或6-4 photolyase的表达恢复了果蝇Dmcry~b突变体对光刺激的反应。(3)构建小菜蛾Pxper和Pxcry2单基因突变体,Pxper和Pxcry2双基因突变体,对突变体的昼夜节律行为进行分析。确认果蝇“无节律”突变体Dmper~(01)的Q464残基在小菜蛾Px PER中的Q382位置是保守的。构建了小菜蛾Pxper基因突变体(Pxper-KO),对应Q382附近的1个碱基对缺失导致翻译提前终止。构建了靶向Pxcry2基因1号外显子区域的突变体(Pxcry2-KO),其为2个碱基对缺失导致缺失处附近翻译提前终止。通过杂交和分子鉴定筛选的方式成功制备Pxper和Pxcry2双突变体Pxper Pxcry2-d KO。昼夜活动节律和羽化节律分析表明,Pxper和Pxcry2突变均导致LD条件下关灯后的活动高峰消失,Pxcry2缺失还导致整体活动量下降和活动节律消失。Pxcry2在DD条件下维持小菜蛾的内源活动和羽化节律至关重要。(4)利用转录组测序分析生物钟基因Pxper和Pxcry2在小菜蛾头部介导的基因表达节律调控差异。LD条件下:对照组小菜蛾头部有1098个节律表达基因,其中大部分基因的节律变化依赖Pxper和Pxcry2的正常功能。Pxper-KO明显影响节律基因表达的相位,而Pxcry2-KO不影响。转录组检测的对照组小菜蛾Pxper和Pxcry2表达节律与q PCR检测的结果一致,Pxcry2的表达相位相比Pxper发生了接近4 h的推迟。不同核心生物钟基因的表达节律或表达水平在Pxper-KO或Pxcry2-KO表现多样,只有部分基因的表达符合PER:CRY2复合体抑制CLK:BMAL1的转录激活能力的模型预测,提示Px PER和Px CRY2对其它核心生物钟基因的调控存在显著差异。大部分核心生物钟基因在Pxper和Pxcry2相关突变体中的表达节律均消失,而Pxcry2在这些突变体中均能维持节律表达,但是节律表达振幅(r AMP)非常明显下降,并且表达相位也发生改变。小菜蛾大脑中的节律基因涉及光转导信号、核苷酸切除、脂肪酸延长和剪接体等多种生物过程,这些生物过程的节律变化同时依赖Pxper或Pxcry2的正常功能。DD条件下:对照组小菜蛾头部的节律表达基因与其在LD条件下的节律表达基因重叠非常低,仅为78个。随着进入DD时间的延长,小菜蛾头部核心生物钟基因的表达节律会非常明显地减弱或消失。综上所述,本课题建立了小菜蛾昼夜活动节律行为监测体系,鉴定表征了小菜蛾关键生物钟基因Pxper和Pxcry2并构建了突变体,昼夜节律行为和转录组分析揭示了小菜蛾Px PER和Px CRY2参与生物钟基因转录翻译反馈环路的可能调控机制。小菜蛾生物钟基因Pxper和Pxcry2介导的昼夜节律行为和分子调控存在差异,并不只是简单的原先假设的PER:CRY2形成复合物一起抑制CLK:BMAL1的转录激活能力,存在更复杂的调控机制。本研究也为夜行性动物生物钟转录翻译反馈调控机制提供一个新的参考模型。