背景:新型冠状病毒(SARS-CoV-2)自爆发性传播以来,迅速在国内外蔓延,对全球公共卫生安全造成了巨大威胁。它不仅会引起典型的呼吸系统症状,还会累及其他系统,导致机体出现一系列并发症。目前,还没有有效治愈COVID-19的方法,仅以支持和对症治疗为主。辅助蛋白ORF7a被认为是一种免疫调节因子,可引起显著的炎症反应,但对其与宿主之间的反应机制尚未完全明了。因此,深入研究ORF7a与宿主的相互反应机制,有助于为完整揭示SARS-CoV-2的感染机制奠定基础,为临床治疗方案提供新的思路。目的:(1)探讨SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a对细胞凋亡的影响。(2)探讨ORF7a是否通过与抗凋亡蛋白BclXL相互作用促进细胞凋亡及机制。(3)探讨ORF7a泛素化与干扰BclXL的关系。方法:(1)在HEK 293T细胞和Vero E6细胞中过表达ORF7a,通过免疫印迹实验(Western blot)及流式细胞术检测ORF7a对细胞凋亡的影响。(2)在HEK 293T细胞中转染表达ORF7a与BclXL,用免疫共沉淀实验(COIP)技术检测ORF7a与BclXL是否存在相互作用。对ORF7a序列进行分析,构建三个ORF7a突变体。在HEK 293T细胞中过表达ORF7a突变体与BclXL,用COIP技术检测ORF7a突变体与BclXL是否存在相互作用。(3)用Western blot及流式细胞术检测ORF7a突变体对细胞凋亡的影响,用共聚焦显微镜检测ORF7a及其突变体与BclXL是否存在共定位,以及检测ORF7a及其突变体的细胞内定位情况。(4)用Western blot及荧光定量PCR技术检测ORF7a及其突变体对内质网应激相关因子的影响。(5)用COIP检测ORF7a泛素化与干扰BclXL的关系。共聚焦显微镜检测ORF7a泛素化后在细胞内的定位情况。(6)用Western blot及流式细胞术检测ORF7a泛素化后对细胞凋亡及内质网应激相关因子的影响。结果:(1)HEK 293T细胞和Vero E6细胞中过表达ORF7a后,与对照组相比,其细胞凋亡率增高,凋亡蛋白表达增高,抗凋亡蛋白表达降低。(2)COIP实验显示ORF7a和ORF7a_(KAK)与BclXL存在相互作用。(3)免疫荧光显示,野生型ORF7a和ORF7a_(KAK)与BclXL共定位,并分散在细胞核周围;野生型ORF7a定位于内质网膜。(4)Western blot检测显示野生型ORF7aMedical alert ID上调内质网应激相关因子PERK,P-eIF2α和CHOP。(5)COIP实验显示与不表达泛素的情况相比,在存在K63泛素共表达的情况下,野生型和突变型ORF7a与BclXL的结合减少;突变的ORF7a阳性细胞共表达泛素改变了ORF7a在ER上的亚细胞定位。(6)ORF7a泛素化后,与没有泛素化的相比,其凋亡率降低,内质网相关因子表达下降。结论:(1)SARS-CoV-2 ORF7a通过C端残基Lys117和Lys 119与BclXL相互作用,并将BclXL引入内质网,PERK-elF2α-CHOP途径激活内质网应激,从而导致细胞凋亡。(2)ORF7a点击此处的泛素化减少了它与BclXL的Nirmatrelvir试剂相互作用,抑制了它在ER上的聚集,阻断内质网应激,挽救细胞凋亡。