研究背景与目的:胰腺激肽酶是一种具有改善微循环作用的血管扩张剂,目前主要用于糖尿病引起的早期肾病。胰激肽原酶肠溶片生物利用度低,为提高其生物利用度,本课题在胰激肽原酶中SAHA作用加入了促渗透剂SNAC,对SNAC的合成工艺进行了研究,并利用Caco-2细胞模型对SNAC促胰激肽原酶的吸收效果进行了评价,确定SNAC与胰激肽原酶的较佳比例,并将SANC与胰激肽原酶混合制备成肠溶胶囊,进行胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学考察,为二类新药的开发奠定基础。方法:通过对SNAC合成的相关专利及文献资料研究,明确了合成SNAC的起始原料,并从安全、经济、绿色等角度出发,考察了相关反应步骤的反应溶剂、辅料用量、反应温度、反应时间以及后处理等,并从产品收率、生产成本、工业化可行性等方面综合考虑优选SNAC合成工艺。利用Caco-2细胞模型对SNAC促胰激肽原酶的吸收效果进行研究。首先利用CCK-8法,进行SNAC和胰激肽原酶对Caco-2细胞的短期毒性的测定;将Caco-2细胞接种到Transwell小室上,进行为期21 d的模型建立,同步进行Caco-2细胞形态学观察、Caco-2细胞单层跨膜电阻、碱性磷酸酶活性、苯酚红通透性等细胞模型评价;模型建立成功后,在Transwell小室上进行SNAC对胰激肽原酶的转运考察,进行了5个比例、为期2 h的考察;最后将每个时间点的转运液利用胰激肽原酶ELISA试剂盒进行胰激肽原酶含量的测定。根据胰激肽原酶肠溶片成人日用量,换算成大鼠一次胰激肽原酶的剂量。利用玛瑙研钵将含SANC的胰激肽原酶和不含SANC的胰激肽原酶进行研磨,测定胰激肽原酶的均一性后,根据效价进行每粒胶囊的装填,然后进行肠溶包衣。利用ELISA试剂盒进行了胰激肽原酶在大鼠空白血浆中的方法学考察;最后进行含SANC与不含SNAC胰激肽原酶肠溶胶囊在大鼠体内的药代动力学研究。结果:1.查阅相关专利和文献,并进行工艺探索,SNAC的合成路线为:首先合成1,3-苯并噁嗪-2,4(3HBelumosudil小鼠)-二酮,即中间体1,以水杨酰胺为原料,以1.2个当量的CDI为缩合剂,THF为反应溶剂,该步反应产物收率达93.5%;其次,合成中间体2,以三乙胺为碱,8-溴辛酸乙酯先加1.1 eq,随着反应再加入0.1 eq,反应体系在55-65℃下,反应时间6-10 h,得到固体后,再用甲叔醚?正庚烷=1?5进行打浆纯化,产物收率在94.9%,降低了生产成本;然后,合成中间体8-(2-羟基苯甲酰氨基)辛酸,以氢氧化钠为开环试剂,反应体系在90-95℃下,反应3-4 h,反应效果较好,产物收率为94.0%;最后,合成SNAC,一步成盐反应,将中间体8-(2-羟基苯甲酰氨基)辛酸用异丙醇溶解,加入4倍水溶解的氢氧化钠,降温析晶,过滤时用异丙醇淋洗,60℃干燥14-20 h,得到最终产物SNAC,收率可达90.8%。2.利用CCK-8法进行Caco-2细胞短期毒性试验,SNAC和胰激肽原酶对Caco-2细胞活性较好的浓度分别不高于1000μg/m L和1200μg/m L。用倒置显微镜观察Caco-2细胞在Transwell上的细胞形态,发现其铺满后多成铺路石状,呈现很好地连接状态;随着培养天数增加,Caco-2细胞单层跨膜电阻TEER值逐渐增加,待第21 d时,TEER值升至976.5Ω*cm~2;随着细胞培养的时间天数的持续增加,细胞在AP侧中与其在BL侧细胞中的碱性磷酸酶酶活力比值出现显著性的加大,这一个结果证明出了APK在其AP侧表达,并因此也证明出现了极化情况,待21d时,AP/BP大于3时,说明Caco-2细胞极化及分化完成;利用苯酚红试验测定21 d时Caco-2细胞的通透性,其表观渗透系数Papp值为7.06×10~(-8)cm/s,小于标准值1×10~(-6)cm/s,进一步地确认了Caco-2细胞的完整性。成功建立Caco-2细胞模型后,进行了胰激酶的SNAC转运实验,加入SNAC?胰激肽原酶=32?1、16?1、8?1、4?1、2?1的实验组中,胰激肽原酶的累积透过量显著高于无SNAC的对照组,加入SNAC的胰激肽原酶累积透过率分别为13.574%、7.597%、10.653%、3.755%、2.523%,且使胰激肽原酶累积透过量分别提高了14.50%、9.50%、26.8%、5.27%、3.9%,累积透过率最高的是SNAC?胰激肽原酶=32?1,且提高的累积透过量也较高。3.根据成人胰激肽原酶肠溶片日用量换算成大鼠为15 U/只;测定胰激肽原酶混合粉末均一性,不含SNAC和含SNAC的胰激肽原酶效价均值分别为1.58、0.87U/mg,RSD分别为5.31%、3.04%,均小于10%。胰激肽原酶在大鼠空白血浆的中专属性考察:胰激肽原酶标准液与含标准品血浆的OD值接近,空白血浆与空白孔对照的OD值接近,表明空白血浆和空白孔均对胰激肽原酶的测定没有干扰;胰激肽原酶检测的质量浓度线性范围为75～1200 ng/L;回收率考察1000、500、100 ng/L的含标准品血浆的中的RSD分别为0.561%、0.813%、2.354%(n=3),且均小于5%,符合试验要求;连续测定3 d,精密度考察1000、500、100 ng/L的含标准品血浆的批内RSD分别为5.01%、3.04%、3.77%(n=3),批间RSD分别为4.39%、3.47%、4.19%(n=9),RSD结果均小于10%,符合试验要求;测1、3、7 d胰激肽原酶-20℃下保存,4℃冰箱缓慢融解的RSD分别为3.14%、7.36%、8.24%(n=9),均小于10%,证明胰激肽原酶在此条件下的稳定性较好。大鼠体内的药代动力学研究结果表明,含SANC胰激肽原酶肠溶胶囊中的胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学AUC_Medical incident reporting(0-12 h)为5679.747 ng/L*h、t_(1/2)为4.569 h;不含SANC胰激肽原酶肠溶胶囊中的胰激肽原酶在大鼠体内的药代动力学AUC_(0-12 h)为4639.665 ng/L*h、t_(1/2)为3.13 h;加入SNAC后,AUC提高了22%;C_(max)也高于不含SANC的胰激肽原酶肠溶胶囊组。结论:研究确定了一条低成本、绿色安全、适合工业化生产的SNAC合成路线,证实了SNAC对胰激肽原酶的促吸收效果,明确SNAC与胰激肽原酶较佳的比例为32?1,为今后开发胰激肽原酶新型口服二类新药打下基础。