研究背景及目的:天然免疫系统介导的抗病毒免疫应答是机体抵御病毒感染的第一道防线。病毒的核酸成分可作为病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),被固有免疫细胞表面的模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别,进而启动抗病毒天然免疫应答。细胞内多种PRRs识别病毒核酸成分后,招募相应的接头蛋白,激活一系列信号转导通路,最终启动Ⅰ型干扰素(Type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)及干扰素诱导基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表达,产生抗病毒效应。病毒感染可破坏宿主细胞内的胆固醇稳态。病毒入侵、脱衣壳、复制、子代病毒组装及释放的过程都需要胆固醇的参与。不仅如此,宿主的胆固醇代谢也是机体抗病毒天然免疫应答的关键调控因素。研究证实,抑制胆固醇合成通路可显著上调IFN-Ⅰ及ISGs的表达,进而抑制病毒感染。因此,调控宿主细胞内的胆固醇稳态,降低胆固醇对病毒的可用性,可在一定程度上抑制病毒的感染,靶向调控宿主的胆固醇稳态已经成为抗病毒治疗的新策略。T 细胞免疫球蛋白及黏蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4,Tim-4)主要表达在抗原提呈细胞表面,在维CL 318952持巨噬细胞稳态和功能方面发挥重要作用。作为磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PtdSer)受体,Tim-4不仅可以促进巨噬细胞对凋亡细胞的吞噬,还能够促进有包膜病毒的入侵过程。然而,Tim-4在抗病毒天然免疫应答中的作用尚不清楚。本文主要探究Tim-4在巨噬细胞抗病毒天然免疫应答中的具体作用,旨在揭示巨噬细胞内胆固醇稳态的调控机制,阐明Tim-4新型生物学功能,并为抗病毒干预策略提供新的候选靶点。研究方法及结果:1.Tim-4抑制巨噬细胞Ⅰ型干扰素应答、促进病毒的复制为探究Tim-4是否参与调控巨噬细胞抗病毒天然免疫应答,首先使用水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)和仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染巨噬细胞,通过western blotting、流式细胞术及qRT-PCR检测,发现病毒感染可上调巨噬细胞中Tim-4的表达。随后,使用VSV、SeV感染,或Poly(I:C)、Poly(dA:dT)刺激野生型(Wild type,WT)和Tim-4敲除(Tim-4 knockout,Tim-4 KO)小鼠的原代腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PEMs),qRT-PCR、ELISA、流式细胞术及 western blotting结果表明,Tim-4缺失显著促进RNA病毒或类似物及DNA类似物诱导的Ⅰ型干扰素通路的活化,同时显著抑制病毒的复制。VSV体内感染实验证实,Tim-4KO小鼠血清及组织中IFN-β的含量显著升高,VSV复制水平降低,肺组织损伤减轻。为排除Tim-4在体内对其他免疫细胞的影响,我们进行了巨噬细胞过继回输实验。受体鼠清除巨噬细胞后尾静脉回输WT或Tim-4 KO PEMs,随后进行VSV感染。结果表明,Tim-4 KO PEMs回输组小鼠血清及组织中IFN-β表达显著上调,VSV病毒载量下降。上述结果表明Tim-4可抑制巨噬细胞中RLR或cGAS诱导的Ⅰ型干扰素通路,促进病毒的复制。2.Tim-4通过增强SREBP2活化促进胆固醇合成抑制巨噬细胞Ⅰ型干扰素应答为明确Tim-4调控巨噬细胞抗病毒天然免疫应答的具体机制,利用WT和Tim-4 KO小鼠PEMs进行转录组测序。基因富集分析结果显示,与Tim-4KO组相比,WT组PEMs中胆固醇稳态相关基因显著富集,提示Tim-4可能与巨噬细胞内胆固醇的稳态相关。Filipin染色及Amplex red胆固醇定量检测结果表明,Tim-4缺失显著下调巨噬细胞内胆固醇的含量。固醇调节元件结合蛋白 2(Sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)是胆固醇生物合成过程中的总调节因子。通过western blotting及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)染色,发现Tim-4能够促进SREBP2的活化及细胞核定位。qRT-PCR结果证明,Tim-4可上调SREBP2下游多种酶的表达。此外,VSV感染后,Tim-4促进巨噬细胞内胆固醇积累及SREBP2活化的作用更加明显Oxidative stress biomarker。使用SREBPs活化抑制剂Fatostatin体外刺激巨噬细胞并进行VSV感染,qRT-PCR、ELISA及western blotting结果显示,Tim-4抑制巨噬细胞中IFN-β产生及IRF3磷酸化的作用消失。WT和Tim-4 KO小鼠腹腔注射Fatostatin后进行VSV感染,结果表明,两组小鼠血清、组织中IFN-β含量、病毒复制水平及病毒载量间无明显差异。另外,干扰Srebf2或补充外源性胆固醇可逆转Tim-4缺失对Ⅰ型干扰素应答和VSV复制的调控作用https://www.selleck.cn/products/wnt-c59-c59.html。上述结果表明,Tim-4通过促进SREBP2的活化及胆固醇生物合成抑制巨噬细胞中I型干扰素通路的活化,进而促进病毒的复制。3.Tim-4抑制Insig1与SCAP结合促进巨噬细胞SREBP2活化及胆固醇合成文献显示,未成熟的SREBP2与SREBP裂解激活蛋白(SREBP cleavage-activating protein,SCAP)组成复合体。当细胞内胆固醇含量较高时,胰岛素诱导基因(Insulin-induced gene,Insigs)结合 SCAP,将 SCAP-SREBP2 复合体滞留于内质网中;当细胞内胆固醇含量较低时,SCAP-SREBP2复合物与Insigs解离,通过COPII囊泡转位至高尔基体。高尔基体中两种金属蛋白酶S1P和S2P依次切割SREBP2,产生NH2末端即活化形式的SREBP2,入核发挥转录调节作用。为明确Tim-4调控SREBP2活化的分子机制,细胞分别转染全长或成熟形式的SREBP2质粒,western blotting检测其活化情况。结果表明,Tim-4可促进全长形式SREBP2的活化,但是对成熟形式SREBP2的水平没有影响,提示Tim-4可能参与SREBP2从内质网到高尔基体的转位过程。进一步通过IF、分离内质网和高尔基体组分,发现Tim-4确实能够促进SREBP2从内质网到高尔基体的转位过程。免疫共沉淀和IF实验进一步证实,Tim-4能够分别与Insig1及SCAP相互作用,抑制Insig1和SCAP间的结合,从而促进SCAP-SREBP2复合体从内质网到高尔基体的转位及后续的活化过程。利用Tim-4不同区域缺失的突变体进行免疫共沉淀及功能验证,发现Tim-4可能通过其胞内段结合Insig1和SCAP,当胞内段缺失后,Tim-4则不能调控巨噬细胞中SREBP2的活化和抗病毒天然免疫应答。综上,Tim-4通过抑制巨噬细胞内Insig1-SCAP的结合促进SREBP2的活化,从而负调控抗病毒天然免疫应答。研究结论及意义:本研究阐明了 Tim-4在调控Ⅰ型干扰素通路中的作用及机制。发现Tim-4通过结合Insig1及SCAP,抑制Insig1和SCAP间的相互作用,促进巨噬细胞内SREBP2的活化及胆固醇从头合成,从而抑制抗病毒天然免疫应答。本研究结果揭示了巨噬细胞胆固醇稳态调控的新机制,为抗病毒药物的研发提供了新靶点,为Tim-4调节胆固醇稳态参与巨噬细胞功能重塑提供了新思路。