研究背景:肿瘤坏死因子α诱导蛋白家族(TNFAIPs)是由肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导表达的蛋白质家族,其家族成员通过参与细胞凋亡、分化、免疫与炎症应答、信号传导等过程,引起多种疾病,尤其是恶性肿瘤和自身免疫性疾病的发生发展。肿瘤坏死因子α诱导蛋白2(TNFα-inducible protein 2,TNFAIP2)是1992年在人脐带血管内皮细胞中发现的由TNF-α诱导表达的进化上保守的单拷贝基因。TNFAIP2蛋白主要定位于细胞质和高尔基体,也在细胞核、核膜,肌动蛋白的膜褶皱和突起中表达。TNFAIP2具有参与炎症反应,血管生成,细胞增殖、粘附、转移、侵袭,隧道纳米管形成等功能。既往研究表明,TNFAIP2在多种肿瘤中有表达,如鼻咽癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌等,已被证实参与鼻咽癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤的转移和侵袭,具有作为肿瘤诊断和预后生物标志物的潜力。本团队前期研究发现,TNFAIP2基因多态性(SNP)与胃癌的风险相关,胃癌患者血清TNFAIP2蛋白表达明显高于健康受试者,但其泛癌表达特征及其在胃肠癌中的作用及机制尚不清楚。综上,本研究通过生物信息学方法对癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中33种肿瘤的TNFAIP2表达及生存数据进行分析,从mRNA水平、DNA水平、表观遗传学等多维度揭示TNFAIP2在泛癌中的表达全景及其预后潜能。以此为基础,进一步聚焦胃肠癌,探索TNFAIP2在胃肠疾病中的表达差异及其与胃肠癌风险/预后的相关性。同时,通过体外实验,深入探讨TNFAIP2表达对胃肠癌细胞生物学行为的影响及作用机制,以期明确TNFAIP2可否作为胃肠癌诊断及预后评估的靶标,为胃肠癌的诊断和个体化精准治疗提供科学依据。研究目的:明确TNFAIP2泛癌表达特征,探索TNFAIP2表达与胃肠癌风险/预后的关系,阐明TNFAIP2对胃肠癌细胞生物学行为的影响及作用机制。研究方法:第一部分:TNFAIP2泛癌表达谱构建1.TCGA 33种肿瘤TNFAIP2表达数据下载本研究使用UCSC XENA(https://xenabrowser.net/)下载了TCGA数据库中33种不同肿瘤类型癌组织样本(10363例)和癌旁组织样本(666例)的RNA-seq信息、临床信息(生存状态、临床分期、生存时间)、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)、微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)、肿瘤微环境(tumor micro-environment,TME)、免疫细胞浸润、基因突变、拷贝数变异(copy-number variant,CNV)、DNA甲基化等数据。2.TNFAIP2泛癌表达谱构建2.1 TNFAIP2表达特征泛癌分析TNFAIP2的差异表达通过R(v4.2.2)的Deseq2软件包来识别。|log FC|≥2和调整后的(adjusted)P<0.05被认定为TNFAIP2具有差异表达。2.2 TNFAIP2表达与肿瘤临床病理参数/预后的相关性分析使用student’s t-test分析TNFAIP2表达与临床分期的相关性。使用KaplanMeier曲线和森林图分析TNFAIP2表达与患者预后的相关性。P<0.05有统计学差异。预后分析包括:总生存期(Overall survival,OS)、疾病相关生存期(Disease-specific survival,DSS)、无进展间隔(Progression free interval,PFI)和无病间隔(Disease free interval,DFI)。2.3 TNFAIP2表达与肿瘤分子表型特征的相关性分析2.3.1 TNFAIP2表达与TMB及MSI的相关性分析TMB被定义为每个基因组兆基的体细胞数量、编码、碱基替代和内德尔突变数。MSI评分来自TCGA数据库。应用R(v4.2.2)计算33种不同肿瘤中,每个样本的TMB和MSI,通过Spearman检验分析TNFAIP2表达与TMB及MSI的相关性。2.3.2 TNFAIP2表达与肿瘤免疫微环境的相关性分析计算33种不同肿瘤类型的肿瘤微环境中基质细胞与免疫细胞的含量,比较TNFAIP2表达与基质细胞及免疫细胞数量的相关性,并进一步分析TNFAIP2表达与不同免疫细胞的关联。我们筛选了55个免疫相关基因,探索免疫相关基因与TNFAIP2共表达情况。2.3.3 TNFAIP2基因突变、CNV、DNA甲基化特征分析对TCGA数据库中TNFAIP2基因突变、CNV、DNA甲基化数据进行分析。以基因突变个数计算突变频率。CNV出现的频率通过CNV扩增和缺失比例计算。TNFAIP2 DNA甲基化的差异表达通过R(v4.2.2)的Limma软件包来识别。分析TNFAIP2基因突变、CNV、DNA甲基化与预后的相关性。3.TNFAIP2 GSEA富集分析通过GSEA网站(https://www.gseamsigdb.org/gsea/downloads.jsp)下载不同肿瘤的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)基因集,利用R(v4.2.2)分析TNFAIP2基因表达矩阵,比较TNFAIP2高表达组与低表达组间每个基因的差异,根据差异程度大小和富集程度来计算富集分数并绘图,解析TNFAIP2在不同肿瘤中参与的信号通路。FDR<0.05被认定为有统计学差异。第二部分:TNFAIP2表达与胃肠癌风险/预后的关联研究1.研究对象:收集自2012年10月至2019年6月于中国医科大学附属第一医院诊断为非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌以及诊断为直肠黏膜炎症、腺瘤、结直肠癌患者的石蜡包埋病理组织切片及新鲜组织样本,其中病理切片例数:非萎缩性胃炎39例,萎缩性胃炎101例,胃癌256例,直肠黏膜炎症54例,腺瘤194例,肠癌134例;新鲜组织样本:胃癌(胃癌及癌旁对照组织)21对,肠癌(肠癌及癌旁对照组织)60对。同时收集胃肠癌患者的临床病理资料及生存信息,每半年对胃肠癌患者进行生存随访。2.实验方法:采用Trizol法提取研究对象新鲜组织总RNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测组织中TNFAIP2 mRNA的表达水平。采用免疫组化染色法检测研究对象病理切片组织中TNFAIP2蛋白表达水平。3.统计分析:采用SPSS(v26.0)进行数据处理;采用Graph Pad(v8.0)进行分析和作图;采用2-ΔΔct计算RNA相对表达量;采用t检验或非参数检验评估计量资料的组间差异;采用ROC曲线进行诊断效能分析;采用χ~2检验或Fisher精确检验分析TNFAIP2表达与临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier曲线和单因素/多因素COX回归分析评估TNFAIP2表达与胃肠癌预后的相关性。P<0.05为差异具有统计学意义。第三部分:TNFAIP2表达对胃肠癌细胞生物学行为的影响及作用机制1.研究对象:胃癌细胞系AGS及肠癌细胞系SW620,均购自国家实验细胞资源共享平台,两种细胞均具有STR鉴定证书。2.构建TNFAIP2过表达质粒,瞬时转染胃肠癌细胞,构建TNFAIP2过表达胃肠癌工具细胞系。3.采用Trizol法提取细胞总RNA,利用RT-qPCR检测胃肠癌细胞中TNFAIP2 mRNA表达水平。提取细胞总蛋白,利用Western Blot检测TNFAIP2蛋白表达水平。4.利用CCK-8细胞活性实验、EdU荧光染色实验评估TNFAIP2对胃肠癌细胞活性及增殖的影响。5.利用Hoechst染色实验及Western Blot检测凋亡相关蛋白表达,评估TNFAIP2对胃肠癌细胞凋亡的影响。6.利用细胞划痕愈合实验、Transwell迁移/侵袭实验评估TNFAIP2对胃肠癌细胞迁移侵袭的影响。7.利用Western Blot检测上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)关键蛋白表达,评估TNFAIP2对胃肠癌细胞EMT的影响。8.利用生物信息学分析寻找胃肠癌组织中TNFAIP2富集的信号通路,Western Blot检测TNFA此网站IP2过表达后通路关键蛋白的表达变化,同时观察胃肠癌细胞生物学行为的变化,明确TNFAIP2影响胃肠癌细胞生物学行为的作用机制。结果:第一部分:TNFAIP2泛癌表达谱构建1.TNFAIP2表达特征泛癌分析1.1不同肿瘤TNFAIP2表达特征在33种肿瘤中,具有癌与癌旁组织TNFAIP差异表达的肿瘤类型共13种。在胃癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、胆管癌、肺腺癌、肺鳞癌、甲状腺癌、食管癌、肾乳头状细胞癌、子宫内膜癌、肝细胞癌和肾透明细胞癌中,肿瘤组织TNFAIP2表达高于癌旁组织;在肾嫌色细胞癌中,肿瘤组织TNFAIP2表达低于癌旁组织。1.2 TNFAIP2表达与肿瘤临床病理参数及预后的相关性在膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、皮肤黑色素瘤、肾嫌色细胞癌、胰腺癌、肾乳头状细胞癌、甲状腺癌、肺鳞癌、睾丸生殖细胞肿瘤等9种肿瘤中,TNFAIP2表达与肿瘤分期相关。在胃癌、膀胱尿路上皮癌和皮肤黑色素瘤中,TNFAIP2高表达组具有更长的OS获益。在胶质母细胞瘤、肾透明细胞癌、胸腺瘤、脑胶质瘤、葡萄膜黑色素瘤和急性髓系白血病中,TNFAIP2低表达组更具OS优势。1.3 TNFAIP2表达与肿瘤分子表型特征的相关性1.3.1 TNFAIP2表达与TMB及MSI的相关性在胃癌、结肠癌、胸腺癌、甲状腺癌、肾乳头状细胞癌、肉瘤等6种肿瘤中,TNFAIP2表达与TMB正相关;在皮肤黑色素瘤、胰腺癌、肺鳞癌、肝细胞癌、急性髓系白血病、多形性胶质母细胞瘤、胆管癌等7种肿瘤中,TNFAIP2表达与TMB负相关。在结肠癌、乳腺癌、肺鳞癌、肺腺癌和甲状腺癌等5种肿瘤中,TNFAIP2表达与MSI正相关;在胰腺癌、子宫癌肉瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤等4种肿瘤中,TNFAIP2表达与MSI负相关。1.3.2 TNFAIP2表达与肿瘤免疫微环境的相关性在结肠癌、直肠癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、多形性胶质母细胞瘤、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、急性髓系白血病、脑胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、睾丸生殖系统肿瘤、甲状腺癌、葡萄膜黑色素瘤中,基质细胞和免疫细胞含量越高,TNFAIP2表达越高。在胃癌、肾上腺皮质癌、乳腺癌、肺鳞癌、卵巢浆液性囊腺癌中,免疫细胞的含量越高,TNFAIP2表达越高。在膀胱癌中,基质细胞和免疫细胞含量越高,TNFAIP2表达越低。在胸腺癌中,基质细胞含量越高,TNFAIP2表达越高。与TNFAIP2表达相关的免疫细胞主要包括:M2巨噬细胞,M1巨噬细胞,调节性T细胞和CD8+T细胞。TNFAIP2共表达免疫相关基因主要包括:TNFRSF9,TNFRSF4,LGAL69,HAVCR2和LAIR1。1.3.3 TNFAIP2基因突变、CNV、DNA甲基化特征TNFAIP2基因突变存在于18种肿瘤中,包括子宫内膜癌、结肠癌、皮肤黑色素瘤、胃癌、宫颈鳞癌和宫颈腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、食管癌、脑胶质瘤、胰腺癌、直肠癌和甲状腺癌。在结肠癌、胃癌、子宫内膜癌中,TNFAIP2基因突变率最高,但与预后没有明显相关性。在33种肿瘤中均存在TNFAIP2拷贝数变异,其中拷贝数扩增比例最高者为睾丸生殖细胞肿瘤、肾嫌色细胞、头颈部鳞癌,拷贝数缺失比例最高者为胆管癌、间皮瘤、宫颈癌。在胃癌、结肠癌、直肠癌中,拷贝数缺失比例较拷贝数扩增比例更高。在4种肿瘤中,包括肾乳头状细胞癌、脑间质瘤、间皮瘤和子宫内膜癌,TNFAIP2拷贝数变异与患者生存相关。在7种肿瘤中,TNFAIP2 DNA甲基化存在差异表达,包括结肠癌、直肠癌、肝细胞癌、头颈部鳞癌、肾透明细胞癌、膀胱癌和肺鳞癌。在III-IV期的膀胱癌,乳腺癌,睾丸癌、肝细胞癌中,TNFAIP2 DNA甲基化水平明显升高;在膀胱癌、脑胶质瘤、胸腺瘤、子宫内膜癌中,年龄≤60岁组TNFAIP2 DNA甲基化水平高于年龄>60岁组。在胃癌、直肠癌、肉瘤、胶质母细胞瘤、食管癌、弥漫大B细胞淋巴瘤、间皮瘤、肾透明细胞癌、膀胱癌、肾乳头状细胞癌、葡萄膜黑色素瘤等11种肿瘤中,高TNFAIP2 DNA甲基化提示良好预后,在乳腺癌、胆管癌、脑胶质瘤、胰腺癌、子宫内膜癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、胸腺瘤等7种肿瘤中,高TNFAIP2 DNA甲基化提示较差预后。2.TNFAIP2 GSEA富集分析TNFAIP2调节多条肿瘤相关信号通路,主要包括:趋化因子信号通路,细胞因子-细胞因子受体通路,JAK-STAT信号通路,T细胞受体信号通路和NK细胞介导的细胞毒性信号通路。第二部分:TNFAIP2表达与胃肠癌风险/预后的关联研究1.不同胃肠疾病TNFAIP2表达特征在胃癌组织中,TNFAIP2 mRNA表达对比癌旁对照组织显著升高(P=0.013);在肠癌组织中,TNFAIP2 mRNA表达与癌旁对照组织没有明显统计学差异(P=0.21)。随着非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎、胃癌的疾病恶性演变进程,TNFAIP2蛋白表达逐渐升高(非萎缩性胃炎vs.萎缩性胃炎,P<0.001;萎缩性胃炎vs.胃癌,P<0.001;非萎缩性胃炎vs.胃癌,P<0.001)。同样地,随着直肠黏膜炎症、腺瘤、肠癌的肿瘤演变进程,TNFAIP2蛋白表达也逐渐升高(直肠黏膜炎症vs.腺瘤,P<0.001;腺瘤vs.肠癌,P<0.001;直肠黏膜炎症vs.肠癌,P<0.001)。2.TNFAIP2表达对胃肠癌的诊断效能评估ROC曲线诊断效能分析结果显示TNFAIP2表达对胃癌具有诊断价值(AUC=0.8039,P<0.0001)。TNFAIP2表达对肠癌也具有诊断价值(AUC=0.8345,P<0.0001)。3.TNFAIP2表达与胃肠癌临床病理参数的相关性在胃癌组织中,TNFAIP2表达与3项临床病理指标显著相关,包括生长方式(P=0.006)、神经侵犯(P=0.024)和Ki-67表达水平(P=0.014),在肿瘤浸润性生长、神经侵犯阳性和Ki-67表达>70%组中,TNFAIP2低表达更为常见。在肠癌组织中,TNFAIP2表达与神经侵犯明显相关(P=0oral biopsy.006),神经侵犯阳性更多出现在TNFAIP2高表达组中。4.TNFAIP2表达与胃肠癌预后的相关性在胃癌组织中,TNFAIP2高表达组对比低表达组OS显著延长(中位OS:未达到vs.50个月,P=0.038);肠癌组织中,TNFAIP2高表达组对比低表达组OS显著缩短(中位OS:107个月vs.未达到,P=0.044)。单因素COX分析表明,TNFAIP2是胃癌良好预后因素(P=0.043;HR=0.501,95%CI=0.257-0.978),TNFAIP2低表达组发生预后不良事件的概率是高表达组的2倍。但多因素COX分析提示TNFAIP2表达并不是胃癌的独立预后因子(P=0.504;HR=0.792,95%CI=0.400-1.568)。TNFAIP2表达是肠癌的预后不良因素(P=0.049;HR=1.989,95%CI=1.004-3.938),并且是独立预后因子(P=0.015;HR=2.399,95%CI=1.189-4.840)。第三部分:TNFAIP2表达对胃肠癌细胞生物学行为的影响及其作用机制1.TNFAIP2过表达工具细胞系的构建在胃癌细胞系AGS和肠癌细胞系SW620中,瞬时转染TNFAIP2过表达质粒,转染效率均达70%。胃癌细胞系AGS中,过表达倍数为100-150倍(P<0.01)。肠癌细胞系SW620中,过表达倍数为200-250倍(P<0.001)。2.TNFAIP2对胃肠癌细胞活性及增殖的影响CCK-8细胞活性实验提示TNFAIP2过表达后,AGS细胞增殖活性没有显著变化,SW620细胞增殖活性显著增强(P<0.01)。EdU荧光染色增殖实验结果显示,AGS细胞增殖在过表达TNFAIP2后显著降低(P<0.001),而SW620细胞增殖显著高于对照组(P<0.01)。3.TNFAIP2对胃肠癌细胞凋亡的影响Hoechst染色实验提示过表达TNFAIP2后AGS细胞的凋亡显著升高(P<0.01),促凋亡基因Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、Bad显著上调,抗凋亡基因Bcl-2显著下调。过表达TNFAIP2后,SW620细胞凋亡显著降低(P<0.001),促凋亡基因Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax、Bad显著下调,而抗凋亡基因Bcl-2显著上调。4.TNFAIPTelaglenastat细胞培养2对胃肠癌细胞迁移侵袭的影响划痕愈合实验显示AGS细胞迁移在过表达TNFAIP2后显著降低(P<0.001),而SW620细胞迁移相比于对照组显著升高(P<0.01)。Transwell迁移/侵袭实验提示,TNFAIP2过表达后AGS细胞迁移侵袭均显著下降(P<0.01)。SW620细胞并不能穿过Transwell小室。TNFAIP2过表达后AGS细胞的N-Cadherin、MMP2、Vimentin、Snail表达量显著下调,E-Cadherin表达显著上调。而SW620细胞中N-Cadherin、MMP2、Vimentin、Snail表达量显著上调,E-Cadherin表达显著下调。5.TNFAIP2影响胃肠癌细胞生物学行为的作用机制KEGG分析结果显示在胃癌组织中,与TNFAIP2共表达差异基因主要富集于破骨细胞分化、趋化因子信号通路、NF-κB信号通路、弓形体病及细胞凋亡信号通路中。在肠癌组织中主要富集于TH17细胞分化通路、趋化因子信号通路、Th1和Th2细胞分化通路、细胞黏附分子通路、抗原处理和呈递通路中,提示TNFAIP2在肠癌中与肿瘤免疫密切相关。GSEA富集分析提示肠癌中,TNFAIP2与MAPK信号通路密切相关(P<0.001,NSE=2.66)。体外实验证实TNFAIP2过表达后,AGS细胞中p-NF-κB、p-Ik Bα表达量明显下调,同时Transwell迁移/侵袭实验提示AGS细胞迁移侵袭显著降低(P<0.001);在SW620细胞中pMEK1/2、p-ERK1/2表达量明显上调,同时EdU荧光染色增殖实验结果显示,TNFAIP2过表达组细胞增殖显著高于对照组(P=0.0013)。结论:1.本研究多维度构建了TNFAIP2泛癌表达谱。全景图显示TNFAIP2在多种肿瘤中差异表达,其与肿瘤临床病理参数、预后、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、肿瘤免疫、基因突变、拷贝数变异DNA甲基化等肿瘤分子特征明显相关。2.随着不同胃肠疾病的恶性演变,TNFAIP2表达逐渐增加,TNFAIP2表达具有作为胃肠癌预警标志物的潜能。3.胃癌组织中TNFAIP2高表达提示胃癌患者良好预后,TNFAIP2是胃癌良好预后因素,但不是独立的预后因子;肠癌组织中TNFAIP2高表达提示预后较差,TNFAIP2是肠癌预后不良因素,且是独立预后因子。4.TNFAIP2可以促进胃癌细胞凋亡,对胃癌细胞增殖有一定的抑制作用,抑制EMT,其可以抑制NF-κB通路抑制胃癌细胞的迁移侵袭。5.TNFAIP2可以抑制肠癌细胞凋亡,且对肠癌细胞迁移有一定的促进作用,促进EMT,其可以激活MAPK通路促进肠癌细胞增殖。