背景:环状RNA(circular RNA)是一种新兴的内源性非编码RNA,是继micro RNA(mi RNA)和long noncoding RNA(lnc RNA)后非编码RNA家族中极具研究潜力的新成员。大量研究表明,环状RNA具有种类多样、序列保守、结构稳定、以及细胞和组织特异性表达等重要特点。近年来,科学家在众多生物中发现了数量繁多的环状RNA,并且发现它们有着关键的生物学功能,例如可以作为mi RNA海绵体吸附并调控其活性,与转录调控元件结PLX-4720细胞培养合或与蛋白相互作用调控基因的转录等。并且研究表明,环状RNA与糖尿病、神经系统疾病、心血管疾病和癌症等疾病相关,因此具有十分重要的研究价值。此外,环状RNA的广泛表达和疾病调控机制使其成为多种疾病的功能生物标志物和治疗靶点。RNA转运出核是真核生物基因表达调控的重要步骤,在真核细胞中,核膜将贮存遗传信息的DNA与翻译遗传信息的核糖体分隔在细胞CL13900核与细胞质中。由RNA介导的遗传信息跨核膜传递为所有真核生物生命活动所必需。新生pre-m RNA在细胞核内完成一系列复杂加工后,成熟m RNA被转运到细胞质中进行翻译,并且m RNA出核转运与pre-m RNA加工过程相互偶联,确保遗传信息的精准表达。新生RNA被准确快速地分选到降解或出核途径是遗传信息精准高效传递的基Chicken gut microbiota本保证,并且具有重要的生物学意义。所以关于RNA出核机制的研究一直以来都是RNA领域研究的热点。但是相比于mRNA环状RNA出核机制相对来说还是一片空白。环状RNA大部分是由编码蛋白质的基因产生,并主要定位在细胞质中。有研究表明果蝇细胞中Hel25E和人类同源蛋白UAP56和URH49介导了环状RNA的转运出核调控。UAP56是TREX复合物组分蛋白,与m RNA转运出核密不可分。研究显示在人类细胞中,短环状RNA(小于400 nt)转运出核需要URH49调控,其中URH49中的RSFS四个氨基酸发挥关键作用。果蝇中长环状RNA(大于800 nt)的核输出需要果蝇Hel25E调控,其中Hel25E中的KKLN四个氨基酸发挥关键作用,而人类细胞中长环状RNA(大于1200 nt)需要UAP56调控,其中UAP56中的KSLN四个氨基酸发挥关键作用。但是哪些蛋白与UAP56和URH49结合从而影响环状RNA的出核尚不明确,有待进一步研究。方法:(1)构建带有HA蛋白标签的UAP56/URH49全长序列(F)以及KSLN/RSFS四个关键氨基酸删除序列(D)和KSLN、RSFS序列互换突变(M)的过表达质粒。(2)在HeLa细胞系中,利用慢病毒包装系统,构建Dox诱导的稳转细胞系。(3)将过表达UAP56-F/D/M和URH49-F/D/M的稳转细胞株进行核质分离,得到不同细胞株的细胞核提取物。(4)利用蛋白免疫沉淀技术纯化UAP56/URH49核内相互作用蛋白,SDS-PAGE后采用考马斯亮蓝染色结合银染查看删除以及突变四个氨基酸序列与全长序列相比的差异性条带。同时通过Western blot用TREX组分抗体检测Co-IP实验效果。(5)通过质谱分析技术鉴定相互作用蛋白组份。将得到的质谱结果进行整理,分析可能影响环状RNA出核的候选蛋白。结果:(1)在PLVX-TRE3G质粒中构建了带有HA蛋白标签的UAP56/URH49全长删除以及突变过表达质粒。(2)瞬时转染48h后裂解细胞得到蛋白样品,Western blot结果显示带有HA蛋白标签的过表达质粒可以在He La细胞中正常表达。(3)在He La细胞中利用慢病毒包装系统,构建了Dox诱导的稳转细胞系,同时Western blot结果显示在过表达稳转细胞系中HA蛋白和目的蛋白表达量同时升高。(4)核质分离实验结果显示,HA-UAP56/HA-URH49定位在细胞核中。(5)HA抗体的蛋白免疫沉淀实验中,纯化与UAP5-F/D/M和URH49-F/D/M相互结合的特异性蛋白。考马斯亮蓝染色结合银染结果显示删除(D)以及突变四个氨基酸序列(M)与全长(F)相比存在明显的差异性条带。同时用TREX组分抗体通过Western blot显示Co-IP实验效率较高。(6)质谱结果显示将UAP56和URH49蛋白中四个关键氨基酸KSLN/RSFS删除以及互换突变后,UAP56/URH49在细胞核内相互作用的蛋白会发生变化。结论:综合上述实验和结果,本课题初步鉴定了UAP56/URH49野生型和影响环状RNA出核的KSLN/RSFS四氨基酸基序突变体的相互作用蛋白。并且鉴定的相互作用蛋白存在RNA定位相关蛋白,它们可能影响环状RNA出核。但是筛选出的蛋白是否会参与调控环状RNA出核,需要进一步的验证。